Целью данного исследования являлась разработка методики количественной оценки целевого антигена в сложной белковой смеси методом MALDI масс-спектрометрии с применением меченых изотопом кислорода 18O пептидов. В качестве сложной белковой смеси выступали лизированные клетки A549, заражённые вирусом гриппа А. Объектом исследования являлся вирусный неструктурный белок NS1, синтезирующийся в заражённых клетках в процессе жизненного цикла вируса. Методику отработали на рекомбинантном белке NS1(1-124) и затем применили на белках лизированных клетках, предварительно разделённых методом ЭФ в ПААГ.

The aim of this work was to develop a method of target antigen quantitative evaluation in a complex protein mixture by MALDI mass spectrometry using isotopomers, peptides that contain stable isotopes of oxygen. Cell lysates of A549 cells infected with influenza virus A were used as a complex protein mixture. The object of study was the NS1 protein. This protein is synthesized in the infected cells during the viral life cycle. The proposed procedure of quantitative evaluation was tested on purified protein NS1 and then applied to the lysed cells that had been previously separated by SDS-PAGE.

• Введение
• 1. Обзор литературы
• 1.1. Масс-спектрометрия
  • 1.1.1. Метод масс-спектрометрии
  • 1.1.2. Масс-спектрометры
  • 1.1.3. Время-пролётный анализатор
  • 1.1.4. Белковая масс-спектрометрия
  • 1.1.5. Метод ионизации распылением в электрическом поле (ESI)
  • 1.1.6. Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с использованием времяпролетного анализатора (MALDI-TOF).
  • 1.1.7. Проблемы количественного масс-спектрометрического анализа и их решения.
  • 1.1.8. Методика количественного анализа целевых белков методом MALDI-TOF
• 1.2. Проблемы современной прикладной вакцинологии
  • 1.2.1. Традиционные подходы в вакцинологии
  • 1.2.2. Новые подходы в современной вакцинологии
  • 1.2.3. Векторные вакцины
• 1.3. Заключение
• 2. Материалы и методы
• 2.1. Материалы
• 2.2. Методы
  • 2.2.1. Определение концентрации белка методом Лоури в модификации Сандермана и Стромингера
  • 2.2.2. Определение концентрации белка по величине поглощения при длине волны λ = 280 нм
  • /
  • 2.2.3. Очистка белка NS1 (1-124) ВГА из клеточной биомассы методом аффинного хроматографического разделения
  • 2.2.4. Дополнительная очистка белка NS1(1-124) ВГА от примесей методом гель-фильтрационного хроматографического разделения
  • 2.2.5. Электрофоретическое разделение в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия в полиакриамидном геле
  • 2.2.6. Окрашивание ПААГ коллоидным раствором Кумасси
  • 2.2.7. Иммуноферментный анализ
  • 2.2.8. Вестерн-блоттинг
  • 2.2.9. Триптический гидролиз белка в растворе
  • 2.2.10. Регистрация и обработка масс-спектров
  • 2.2.11. Модификация пептидов изотопом кислорода 18O
  • 2.2.12. Пример расчета концентрации целевого пептида методом MALDI масс-спектрометрии с использованием стандарта
  • 2.1.13. Заражение клеток вирусами гриппа А.
  • 2.2.14. Триптический гидролиз в геле
• 3. Результаты
• 3.1.Хроматографическая очистка целевого белка
  • 3.1.1. Очистка рекомбинантного белка NS1(1-124) методом металл-хелатной аффинной хроматографии
  • 3.1.2. Дополнительная очистка рекомбинантного белка NS1(1-124) методом гель-фильтрационного хроматографического разделения
• 3.2. Идентификация рекомбинантного белка NS1(1-124) ВГА методом MALDI масс-спектрометрии и выбор референсных пептидов
  • 3.2.1. Идентификация очищенного рекомбинантного белка NS1(1-124)
  • 3.2.2. Выбор референсных пептидов
  • 3.2.3 Модификация синтетических аналогов пептидов изотопом кислорода 18О
• 3.3. Оптимизация метода количественной оценки в модельной системе
• 3.4. Валидация антител к NS1 ВГА методами ИФА и вестерн-блоттинга
  • 3.4.1. Проверка функциональности различных антител к NS1 ВГА
  • 3.4.2. Определение порога чувствительности антител «5D2»
• 3.5. Заражение клеток А549 вирусом гриппа А
  • 3.5.1. Выбор дозы заражения клеток A549 вирусом гриппа
  • 3.5.2. Определение времени накопления белка NS1 в заражённых клетках
• 3.6. Определение концентрации целевого антигена в сложной белковой смеси методом MALDI масс-спектрометрии
  • 3.6.1. Триптический гидролиз целевого антигена в геле
  • 3.6.2. Идентификация полноразмерного белка NS1 в суспензии заражённых клеток
  • 3.6.3. Масс-спектрометрическая количественная оценка целевого антигена с применением референсных модифицированных пептидов
• 4. Обсуждение
• Заключение.
• Выводы
• Список использованных источников
• Приложение 1
  • 1.1. Пример расчета концентрации целевого пептида методом MALDI масс-спектрометрии с использованием стандарта
• Приложение 2
  • 2.1. Очистка рекомбинантного белка NS1(1-124) методом металл-хелатной аффинной хроматографии.
• Приложение 3
  • 3.1. Дополнительная очистка рекомбинантного белка NS1(1-124) методом гель-фильтрационного хроматографического разделения