Данная работа посвящена созданию и исследованию свойств резорбируемого гемостатического материала на основе волокон из хитозана. Исследованы молекулярная масса и степень деацетилирования различных образцов хитозана, вязкость их растворов. Получены нити мокрым методом с различными параметрами формования и проведены механические испытания. Разработан нетканый кровеостанавливающий материал и исследована его эффективность.

• 2.4. Изучение реологических свойств растворов..…………………...
• 2.5. Формование волокон……………………………………………….
• 2.6. Механические испытания волокон………………………………...
• 2.7. Получение нетканого материала……………………………….….
• 2.8. Исследование кровеостанавливающих свойств………………….
• Глава 3. Результаты и их обсуждение………………………………….
• 3.1. Определение молекулярной массы хитозана……………………
• 3.2. Исследование степени деацетилирования…………………………
• 3.4. Формование волокон мокрым методом……………………………
• 3.5. Механические свойства волокон из хитозана………….…............
• 3.6. Цитотоксические испытания……………………………………….
• 3.7. Исследование эффективности нетканого гемостатического материала…………………………………………………………………
• Глава 4. Выводы………………………………………………………….
• ВВЕДЕНИЕ
• Потребность в новых биоматериалах растёт с каждым годом. Несмотря на достаточно широкий рынок использующихся в медицинской практике материалов, все они имеют определённые недостатки и ограниченность применения. Перспективным направлением является созд...
• 1.1. Хитин и хитозан
• Благодаря наличию аминогрупп, хитин и хитозан являются перспективными полимерами ввиду возможности их модификации с помощью таких химических реакций как ацетилирование (деацетилирование), алкилирование, реакции с альдегидами и кетонами с целью приобре...
• На свойства получаемых материалов большое влияние оказывает не только химический состав и строение вещества, но и степень полимеризации макромолекул, определяющая молекулярную массу как:
• M = n m,
• где M – молекулярная масса макромолекулы;
• n – степень полимеризации;
• m – масса элементарного звена.
• В процессе синтеза получаемые макромолекулы имеют разную степень полимеризации, а, значит, и различные значения молекулярной массы. За счёт того, что полимеры обычно состоят из молекул различной длины, значение молекулярной массы полимера, определенно...
• Средневесовая молекулярная масса экспериментально определяется такими методами как светорассеяние и седиментация, которые позволяют установить массу отдельных макромолекул. Она определяется по формуле:
• ,𝑴-𝒘.= ,,,𝒏-𝒊.∗,𝑴-𝒊-𝟐..-,,𝒏-𝒊.∗,𝑴-𝒊...,
• где ,𝑴-𝒘. – средневесовая молекулярная масса;
• ,𝒏-𝒊. – число молекул с молекулярной массой ,𝑴-𝒊.;
• ,𝑴-𝒊. – молекулярная масса отдельной молекулы.
• Определение среднечисленной молекулярной массы основано на определении числа молекул в разбавленных растворах полимеров. К таким методам относят эбулиоскопию и криоскопию (измерение повышения температуры кипения или понижения температуры замерзания ра...
• ,𝑴-𝒏.= ,,,𝒏-𝒊.∗,𝑴-𝒊..-,,𝒏-𝒊...,
• где ,𝑴-𝒏. – среднечисловая молекулярная масса.
• Чаще всего на практике определяют средневязкостную молекулярную массу ввиду простоты метода (определение вязкости разбавленных растворов полимера) и близости к значению средневесовой молекулярной массы [12].
• Важным показателем является полидисперсность, определяемая как отношение средневесовой молекулярной массы к среднечисленной и характеризующая ширину молекулярно-массового распределения (рис. 2.1). В идеальном случае полидисперсность равна единице, чт...
• Рис. 2.1. Дифференциальные кривые для полимеров с различным молекулярно-массовым распределением (ММР): 1- узкое ММР, 2 – широкое ММР
• 2.2.2. Вискозиметрия
• Среди множества методов определения средневязкостной молекулярной массы одним из наиболее простых и удобных является вискозиметрия. Вязкость полимера, которая характеризует внутреннее трение в жидкости при её течении, зависит от факторов, определяющих...
• Измерение молекулярной массы полимера вискозиметрическим методом основано на определении его вязкости, что достигается путём измерения времени истечения раствора через капилляр вискозиметра при определённом значении температуры окружающей среды.
• Наиболее распространёнными вискозиметрами считаются капиллярные вискозиметра Оствальда (рис.2.2, а) и Уббелоде (рис.2.2, б,в). Их главное отличие заключается в том, что вискозиметры Оствальда удобнее использовать при измерении одной концентрации, а Уб...
• Ещё одним преимуществом вискозиметра Уббелоде является возможность проводить разбавление раствора в самом вискозиметре, так как отсутствует необходимость использования одинаковых количеств раствора или растворителя, что отличает его от вискозиметра Ос...
• Не менее важным элементом в вискозиметрии является термостат, в который погружается вискозиметр. Он позволяет поддерживать необходимую температуру, для чего снабжается мешалкой, нагревателем и термометром, а также устройством для фиксации вискозиметра.
• Рис. 2.2 Вискозиметры Оствальда (а) и Уббелоде (б,в): 1 – резервуар; 2,3,4 – трубки; 5 и 7 – метки; 6 и 8 – шарики.
• Перед самим экспериментом необходимо приготовить растворы полимера, молекулярная масса которого будет определяться. В случае исследования молекулярной массы хитозана методом разбавления это происходит следующим образом:
• 1. Подготовка и взвешивание бюкса хитозана (для концентрации 0,4% навеска составляла примерно 0,6 г);
• 2. Добавление к навеске 15 мл 2% раствора уксусной кислоты;
• 3. Взвешивание полученного раствора, по результатам которого пересчитывается точная концентрация хитозана;
• 4. Перемешивание раствора в течение часа;
• 5. Добавление 0,26 г NaCl из расчёта 0,3 моль NaCl на 15 мл 2% раствора уксусной кислоты и дальнейшее перемешивание;
• 6. Приготовление контрольного раствора (растворителя), для чего 45 мл 2% раствора уксусной кислоты перемешивается с78 г NaCl;
• 7. Полученные растворы оставляются на ночь в холодильнике.
• Для измерения молекулярной массы хитозана использовался вискозиметр Оствальда ввиду отсутствия необходимости разбавления раствора в самом вискозиметре. Эксперимент начинается с измерения времени истечения растворителя через капилляр вискозиметра, поме...
• После нахождения времени истечения растворителя τ0 и его удаления из вискозиметра исследуется приготовленный раствор хитозана аналогичным способом после фильтрования (размер пор фильтра составлял 160 мкм) и находится среднее время истечения раствора τср.
• При измерении молекулярной массы требуется исследовать не менее 4 концентраций, которые получаются методом разбавления раствора (в случае измерений для хитозана концентрации составляли 0,4%; 0,3%; 0,2%; 0,1%). Для получения следующего значения исследо...
• ,𝒎-р−ля. = ,,𝒎-хит.∗𝟏𝟎𝟎 – ,𝑪-необх.∗ ,𝒎-р−ра.-,𝑪-необх.. ,
• где ,𝐦-р−ля. – масса растворителя, который надо добавить;
• ,𝐦-хит. – масса хитозана;
• ,𝐂-необх. – новая концентрация хитозана, для получения которой добавляется растворитель;
• ,𝐦-р−ра. – масса раствора, перелитого из вискозиметра в цилиндр.
• При этом масса хитозана находится по следующей формуле:
• ,𝐦-хит.= ,,𝒎-р−ра.∗𝟏𝟎𝟎-,𝑪-хит.. ,
• где ,𝑪-хит. – пересчитанная концентрация хитозана в этом растворе.
• После добавления растворителя пересчитывается полученная концентрация хитозана в растворе ввиду маловероятного совпадения рассчитанного и добавленного в действительности количества растворителя.
• Аналогичным образом измеряется время истечения полученного раствора со следующим значением концентрации и производится дальнейшее разбавление. Данная процедура повторяется для всех заранее выбранных концентраций.
• Далее следует непосредственно вычисление молекулярной массы полимера по полученным значениям времени истечения растворов разной концентрации. Для этого используются следующие понятия:
• Относительная вязкость ηотн – это отношение времени истечения раствора к времени истечения растворителя и, соответственно, определяется следующей формулой:
• ηотн = ,,𝛕-ср.-,𝛕-𝟎..
• Удельная вязкость ηуд – отношение разности времён истечения раствора и растворителя к времени истечения растворителя:
• ηуд = ,,𝛕-ср.− ,𝛕-𝟎.-,𝛕-𝟎.. = ηотн -1
• Приведённая вязкость ηпр – отношение удельной вязкости к концентрации раствора:
• ηпр = ,,𝛈-уд.-С. ,
• где С – концентрация раствора.
• Для расчёта вышеперечисленных величин удобно представлять данные в виде таблицы, где по вертикали указывается номер опыта, а по горизонтали соответственно концентрация раствора, время его истечения, значения относительной, удельной и приведённой вязко...
• Затем строится график в координатах ηпр (C), по которому находится характеристическая вязкость [η] как пересечение прямой, построенной по полученным точкам, с осью ординат. С помощью полученного значения находят молекулярную массу по формуле Марка-Хуа...
• [η] = К*ММα,
• где ММ – искомая молекулярная масса;
• К, α – коэффициенты, которые постоянны для данного полимера в данном растворителе. Для хитозана, растворённого в уксусной кислоте и хлориде натрия, они соответственно равны 3,44*10-5 и 1,02.
• 2.2.3. Исследование степени деацетилирования
• Степень деацетилирования – это отношение количества глюкозаминных звеньев к общему числу мономерных звеньев в молекуле полисахарида. Ею характеризуется степень перехода хитина в хитозан. Однако в природе не существует полностью деацетилированного хито...
• Существует много методов по определению степени деацетилирования, в число которых входят хроматография, инфракрасная и ультрафиолетовая спектроскопия, кондуктометрическое титрование. Последний является одним из наиболее простых и удобных, а также не т...
• Метод основан на связывании HCl с аминогруппами хитозана, избыток кислоты в получаемом растворе оттитровывают щёлочью.
• Перед непосредственно измерением необходимо приготовить растворы хитозана. Для этого делают не менее двух навесок хитозана массой около 0,2 г, в каждую из которых добавляется по 20 мл HCl, что соответствует 0,1 Н, после чего растворы перемешиваются в ...
• Для проведения эксперимента используется бюретка на 5 мл, которую необходимо предварительно промыть дистиллированной водой и щёлочью (NaOH), используемой для титрования. Для получения точного результата необходимо определить её нормальность, что делае...
• NNaOH = ,,𝐍-𝐇𝐂𝐥.∗,𝐕-𝐇𝐂𝐥.-,𝐕-𝐍𝐚𝐎𝐇.. ,
• где NNaOH – нормальность щёлочи;
• ,𝐍-𝐇𝐂𝐥. – нормальность кислоты;
• ,𝐕-𝐇𝐂𝐥. – объём кислоты;
• ,𝐕-𝐍𝐚𝐎𝐇. – объём оттитрованной щёлочи.
• После определения нормальности щёлочи можно приступать к измерению степени деацетилирования хитозана, для чего в раствор хитозана помещают электрод и добавляют воду так, чтобы электрод был полностью погружён в раствор. Титрование проводится путём доба...
• Для нахождения значения степени деацетилирования необходимо построить график зависимости проводимости от объёма титранта, на котором убывающий участок соответствует избыточному количеству соляной кислоты, восходящий – щёлочи, а плато – содержанию перв...
• Вычисление степени деацетилирования (СД) хитозана производят по следующей формуле:
• СД= ,𝟐𝟎𝟑∗𝒎-𝑮−𝟏𝟔𝟏∗𝒎+𝟐𝟎𝟑∗𝒎 .∗𝟏𝟎𝟎% ,
• где m = VNaOH*Т – количество аминосодержащих звеньев хитозана;
• Т= NNaOH – титр раствора NaOH в HCl;
• G - навеска хитозана;
• коэффициент 203 – молекулярная масса мономерного звена хитина;
• коэффициент 161 – молекулярный вес ацетилированного звена хитозана.
• За окончательный результат принимается среднее арифметическое полученных результатов.
• 2.3. Приготовление растворов из хитозана
• Для приготовления раствора из хитозана предварительно высчитывается необходимая масса навески исходя из требуемых концентрации полимера и объёма. К навеске добавляется требуемое количество воды, и полученный раствор перемешивается в течение 30 минут, ...
• 2.4. Изучение реологических свойств растворов
• В процессе прохождения раствора через фильеру возникают сдвиговые напряжения, формирующие его ориентационную структуру. Для определения оптимальных условий формования волокон (концентрация раствора, скорость его подачи) были проведены реологические из...
• 2.4. Формование волокон
• Формование волокон осуществляется коагуляционным методом на лабораторной установке ИВС РАН, схема которой представлена на рисунке 2.3. Раствор подаётся с помощью шприцевого насоса через фильеру с одним отверстием диаметром 0,6 мм для получения монофил...
• Рис. 2.3. Схема установки для формования волокон. 1 – подача раствора; 2 – прохождение раствора через фильеру; 3 – осадительная ванна; 4,8 – ролики; 5,6 – промывочные ванны; 7 – система просушки.
• 2.5. Механические испытания волокон
• Перед испытаниями волокна и нити были выдержаны при нормальных климатических условиях (относительной влажности 66 % и температуре 20± 2 С) не менее 24 часов. Измерения механических свойств волокон проводили на разрывной машине Instron 5943, базовая д...
• 2.6. Получение нетканого материала
• Для изготовления нетканого гемостатического материала были получены полифиламентные нити с различным количеством элементарных нитей (от 12 до 100), диаметр которых был равен приблизительно 10 мкм. Далее нити гофрировались с использованием установки, п...
• Рис. 2.4. Установка для гофрирования нитей
• 2.7. Исследование кровеостанавливающих свойств
• Для определения гемостатического эффекта полученного нетканого материала были проведены опыты in vivo на крысах. Для экспериментов использовали самцов белых крыс Wistar в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных жив...
• Было измерено время остановки кровотечения полученных нетканых материалов из хитозановых волокон в сравнении с коммерчески доступными гемостатическими образцами при перфорировании печени на 3 мм и рассечении бедренной вены крысы. Для изучения эффектив...
• Исследования цитотоксичности хитозана проводили на предварительно приготовленных плёнках в следующем порядке:
• 1. Экспериментальные образцы пленок дезинфицировали, нарезали круглыми фрагментами по размеру лунки 24-луночного культурального планшета и помещали в лунки;
• 2. В лунки добавляли суспензию клеток в полной культуральной среде, содержащую 25 тысяч клеток;
• 3. Проводили инкубацию клеток в течение необходимых промежутков времени (1 и 4 суток);
• 4. Заменяли ростовую среду на раствор МТТ (тиазолиловый синий тетразолий-бромид) и инкубировали образцы 2 часа;
• 5. Удаляли раствор, а образовавшиеся кристаллы формазана экстрагировали, добавляя в лунки DMSO (диметилсульфоксид);
• 6. Тщательно перемешав получившийся раствор семплером, разаликвочивали его по лункам 96 луночного культурального планшета;
• 7. Регистрировали оптическую плотность раствора с использованием спектрофотометра SPECTROstar Nano на длине волны 570 нм; оптическая плотность коррелирует с количеством жизнеспособных клеток.