Данная работа посвящена оценке способности некоторых абиотических и биотических стрессирующих факторов индуцировать программируемую клеточную гибель (ПКГ) в тканях проростков ячменя Hordeum vulgare L. В качестве абиотических факторов выступали хлорид натрия, хлорид алюминия, дефицит калия в среде выращивания и кратковременный тепловой шок. В качестве биотического фактора использовался раствор хитозана, имитирующего грибное заражение в тканях растения. Факторы были выбраны среди наиболее важных стрессоров, которым подвергаются посевы ячменя при культивировании на полях РФ, а также исходя из современных экологических проблем, грозящих существенным снижением урожайности данного злака. Результаты экспериментальных воздействий, проведенных в данной работе, анализировались с помощью методик выделения ДНК из корней и листьев ячменя и электрофоретической визуализацией в агарозном геле. Оценка способности эффекторов приводить к программируемой клеточной гибели производилась на основании одного из важнейших симптомов ПКГ, а именно - формирования межнуклеосомных разрывов геномной ДНК специализированными нуклеазами. При индукции нуклеазной активности происходило образование смеси фрагментов ДНК, что выявлялось по появлению характерной «лесенки» в агарозном геле. Установлено, что хлорид натрия в диапазоне концентраций от 50 до 500 мМ в течение 24 ч инкубации не индуцирует ПКГ в клетках корней проростков ячменя сортов Donaria и Донецкий-8. Хлорид алюминия в диапазоне концентраций 0,1-1 мМ при длительном воздействии (от 3 до 48 ч) не приводит к межнуклеосомной фрагментации ДНК в клетках корней проростков ячменя сортов Donaria и мутанта clo f2 3613. Дефицит калия в среде выращивания не индуцирует ПКГ в клетках корня 7 суточных проростков ячменя. Кратковременный тепловой шок индуцирует ПКГ, сопровождающуюся олигонуклеосомной фрагментацией ДНК, в клетках корня проростков ячменя. Элиситор хитозан, имитирующий биотический фактор, вызывает межнуклеосомную фрагментацию ДНК в клетках корня ячменя только при длительной инкубации в течение 7 суток. Программируемая клеточная гибель играет существенную роль во множестве важных процессов, необходимых для роста и развития растений. Несмотря на это, на сегодняшний день ПКГ остается явлением, не до конца охарактеризованным на цитологическом и молекулярно-биохимическом уровне. В связи с увеличением перспективности изучения ПКГ растений, становится особенно важным создание общепринятой классификации типов клеточной гибели, чего невозможно достичь без понимания механизмов действия провоцирующих клеточную гибель индукторов. На изучение индукторов ПКГ у растений и направлена данная работа.

This work aimed at investigation of the ability of several abiotic or biotic stress factors to induce programmed cell death (PCD) in the tissues of barley (Hordeum vulgare L.) seedlings. The abiotic stress factors were elevated levels of sodium chloride or of aluminum chloride in the growth medium, potassium deficiency in the growth medium, or short-term heat shock. Solution of chitosan was used as an imitation of a fungal infection in plant tissues (a biotic stress factor). These stress factors were selected based on their prevalence and importance for the sustained growth of barley. The experiments presented in this study were based on DNA isolation techniques and subsequent visualization of the isolated DNA samples on agarose gels using electrophoresis. The ability of the stress factors to induce PCD was assessed on the basis of one of the main PCD symptoms, namely, the formation of internucleosomal cuts of genomic DNA by specific nucleases. The induction of the nuclease activity was visualized on agarose gels as a specific "ladder" of DNA fragments. It was found that sodium chloride in the concentration range from 50 to 500 mM during 24 h of incubation did not induce PCD in the root cells of Donaria and Donetsky-8 seedlings. Similarly, aluminum chloride in the concentration range of 0.1-1 mM with prolonged exposure (from 3 to 48 h) did not lead to internucleosomal DNA fragmentation in the root cells of Donaria and the clo f2 3613 mutant. Potassium deficiency in the growing medium did not induce PCD in root cells of 7 day seedlings of barley. On the contrary, short-term heat shock induced PCD in the barley root cells which was accompanied by oligonucleosomal DNA fragmentation. The elicitor chitosan caused internucleosomal DNA fragmentation in barley root cells after long-term incubation for 7 days. PCD plays a significant role in many important functions necessary for plant growth and development, but despite this, PCD remains not fully characterized at the cytological and molecular level. It becomes increasingly important to create a generally accepted classification of cell death types in plants, and this requires understanding the mechanisms of cell death induction and the steps leading to the different types of cell death.

• СОДЕРЖАНИЕ
• СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • 1.1. Морфологическая классификация типов гибели клеток растений
    • 1.1.1. «Вакуолярная» гибель клеток растений
    • 1.1.2. Некротическая запрограммированная гибель клеток растений
    • 1.1.3. Типы ПКГ, сочетающие симптомы вакуолярной и некротичеcкой гибели клеток
  • 1.2. Роль апоптозоподобной ПКГ в вегетативном и репродуктивном развитии растений
  • 1.3. Молекулярные и клеточные механизмы индуцированной стрессом апоптозоподобной клеточной гибели растений
    • 1.3.1. Роль митохондрий
    • 1.3.2. Роль каспазоподобных ферментов в клетках растений
    • 1.3.3. Синтез белка de novo
    • 1.3.4. Изменения гомеостаза ионов кальция
  • 1.4. Факторы стресса, вызывающие развитие ПКГ
    • 1.4.1. Температурные воздействия
    • 1.4.2. Тяжелые металлы
    • 1.4.3. Засоление
  • 1.5. ПКГ в иммунитете растений (индукция биотическими стрессовыми факторами)
    • 1.5.1. ПКГ, ассоциированная с гиперчувствительным ответом
    • 1.5.2. Вызванная хитозаном гибель клеток
• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  • 2.1. Объекты исследования
  • 2.2. Методики выделения ДНК
    • 2.2.1 Выделение геномной ДНК с помощью модифицированного CTAB-метода
    • 2.2.2. Метод выделения геномной ДНК согласно методу Hameed с соавторами
  • 2.3. Электрофорез в агарозном геле
  • 2.4. Выращивание растений ячменя
  • 2.5. Способы индукции ПКГ в корнях проростков ячменя
• ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
  • 3.1. Влияние хлорида натрия на индукцию ПКГ в клетках корня ячменя
  • 3.2. Влияние хлорида алюминия на индукцию ПКГ в клетках корня ячменя
  • 3.3. Действие элиситора хитозана
  • 3.4. Действие кратковременного теплового шока на индукцию ПКГ в клетках корня ячменя
  • 3.5. Влияние дефицита калия в среде выращивания на индукцию ПКГ
• ВЫВОДЫ
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ