Квалификационная работа бакалавра посвящена разработке нового подхода для создания прототипов вирусно-бактериальной векторной вакцины на основе штаммов для живой гриппозной аттенуированной реассортантной вакцины (ЖГВ). В процессе работы был проведен глубокий анализ современной литературы по состоянию проблематики векторных вакцин на текущий момент, а также разработки отдела вирусологии им.А.А.Смородинцева в Институте Экспериментальной Медицины по созданию ряда векторных вакцин против различных инфекционных заболеваний. Было определено, что наиболее перспективной стратегией для векторной вакцины против стрептококковой инфекции будет являться встраивание генетического материала стрептококка в ген NS донора аттенуации для ЖГВ. Для этого были разработаны различные дизайны для химерного NS-гена с добавлением пептидов PADRE, LAMP-1, сигнального пептида и трансмембранного домена Н7 для направленного синтеза белка в различные компарменты клетки. В качестве иммуногенных вставок стрептококка были выбраны участки поверхностного липопротеина Sca длиной 87, 141, 200 и 287 аминокислот, нуклеотидная последовательность каждой вставки была получена методом перекрывающейся ПЦР. А также получена универсальная плазмида для обратной генетики со вставкой модифицированного NS гена для следующих этапов разработки векторной вакцины против стрептококковой инфекции.

The bachelor’s qualification work is devoted to the development of a new approach for prototyping a viral-bacterial vector vaccine based on strains for live influenza attenuated reassortant vaccine (VHV). In the process, an in-depth analysis of modern literature on the current state of the problems of vector vaccines was carried out, as well as the development of the A. A. Smorodintsev Virology Department at the Institute of Experimental Medicine to create a series of vector vaccines against various infectious diseases. It has been determined that the most promising strategy for a vector vaccine against streptococcal infection will be the incorporation of the genetic material of streptococcus into the NS gene of the attenuation donor for PLWH. For this, various designs were developed for the chimeric NS gene with the addition of the PADRE, LAMP-1 peptides, the signal peptide and the H7 transmembrane domain for targeted protein synthesis in various cell compartments. Sections of surface Sca lipoprotein 87, 141, 200 and 287 amino acids in length were selected as immunogenic streptococcus inserts; the nucleotide sequence of each insert was obtained by overlapping PCR. A universal plasmid for reverse genetics with the insertion of a modified NS gene for the next stages of the development of a vector vaccine against streptococcal infection was also obtained.

• 6ea4c6a6872637f6b12ac56c61877425d46522293fd7843cfabd05d9c20d4870.pdf
• САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
• 6ea4c6a6872637f6b12ac56c61877425d46522293fd7843cfabd05d9c20d4870.pdf
  • ВВЕДЕНИЕ
  • ГЛАВА 1. Обзор литературы.
  • ГЛАВА 2. Материалы и методы
    • 2.1. Материалы
    • 2.2. Методы
      • 2.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
      • 2.2.2. Перекрывающаяся ПЦР
      • 2.2.3. Электрофоретическое разделение ДНК
      • 2.2.4. Выделение ДНК из агарозного геля
      • 2.2.5. Рестрикция
      • 2.2.6. Лигирование
      • 2.2.7. Трансформация бактерий.
      • 2.2.8. ПЦР колоний
      • 2.2.9. Выделение плазмидной ДНК
        •  1-2 мл бактериальной культуры переносится в пробирку, после чего центрифугируется в течение 1 минуты на 1700 g, потом удаляется супернатант.
        •  Далее к осадку добавляется 250 мкл «Ресуспендирующего раствора» и тащтельно ресуспендируется.
        •  Далее добавляется 250 мкл «Лизирующего раствора». Содержимое пробирки аккуратно переворачивается до становления раствора прозрачным.
        •  Далее добавляется 250 мкл «Нейтрализующего раствора», содержимое пробирки переворачивается до появления творожистой взвеси. После чего пробирка центрифугируется в течение 10 минут на максимальной скорости.
        • Далее все центрифугирования проводятся на скорости до 7000 g
        •  Спин колонка помещается в собирательную пробирку.
        •  На фильтр колонки наносится 20 мкл «Раствора для удаления эндотоксинов». После чего осветленный супернатант переносится в спин-колонку и подвергается ценитрифугированию на 30 секунд.
        •  Фильтрат из собирательной пробирки удаляется.
        •  Далее в колонку добавляется 700 мкл «Промывочного раствора», и все центрифугируется в течение 30 секунд.
        •  Фильтрат из собирательной пробирки удаляется. (1)
        •  После чего пустая колонка центрифугируется 1 минуту для полного удаления «Промывочного раствора».
        •  Далее колонка помещается в новую пробирку ( 1,5-2 мл) и оставляется при комнатной температуре на 5 минут для полного испарения остатков спирта.
        •  После чего в центр мембраны наносится 50 мкл «Элюирующего раствора» и пробирка инкубируется при комнатной температуре 1 минуту.
        •  Далее проводится центрифугирование в течение 30 секунд, и собранная очищенная ДНК используется для дальнейших генетических методов.
  • ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение
    • 3.1. Оценка возможностей генома вируса гриппа для встраивания чужеродных генов.
    • 3.2. Таргетинг чужеродных белков в векторной вакцине на основе ЖГВ.
    • 3.3. Разработка праймеров для получения пилотных конструкций Sca в гене NS без дополнительного таргетинга.
    • 3.4. Получение кассет Sca87, Sca141, Sca200, Sca287 для дальнейшего клонирования в ген NS.
    • 3.5. Получение плазмиды pcI со вставкой усеченного гена NS126 донора аттенуации Лен17 с сайтами рестрикции BsmBI.
  • ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  • СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
  • 21. Irina Isakova-Sivak , Victoria Matyushenko , Ekaterina Stepanova , Anastasia Matushkina , Tatiana Kotomina , Daria Mezhenskaya , Polina Prokopenko , Igor Kudryavtsev , Pavel Kopeykin , Konstantin Sivak , Larisa Rudenko. Recombinant live attenuated...