Тема выпускной квалификационной работы: «Детекция мутаций в генах KRAS, NRAS, BRAF в образцах с малым процентным содержанием опухолевых клеток методом цифровой ПЦР (dPCR)». В современной диагностике рака легких и рака толстой кишки важным прогностическим фактором лечения является установление мутационного статуса в генах KRAS, NRAS и BRAF. Выявление мутаций в этих генах может помочь врачам в корректировании лечения пациента и назначении таргетной терапии. В образцах с низким процентным содержанием опухолевой ткани не всегда удаётся выявить точечную мутационную замену в ДНК классическими методами (секвенирование по Сэнгеру, аллель-специфическая ПЦР), поэтому в данной работе мы воспользовались более чувствительным методом – Цифровой ПЦР (Digital PCR, dPCR), который дает возможность проверки образцов, содержащих всего 1-2% опухолевой ткани. В данном исследовании была создана тест-система для проверки наличия мутаций в 37 частых случаях в генах KRAS, NRAS и BRAF: были оптимизированы условия ее проведения и созданы дизайны праймеров и проб. Было проанализировано 1919 образцов с диагнозом РТК и 1566 образцов с диагнозом РЛ, из них было отобрано 66 образцов РЛ и 65 образцов РТК без ранее выявленных мутаций в генах KRAS, NRAS, BRAF с низким процентным содержанием опухолевой ткани (<10%). После двухступенчатой перепроверки на цПЦР и капельной цПЦР в 7 образцах был подтвержден мутационный статус, что свидетельствует о том, что методы, основанные на цифровой ПЦР, позволяют выявлять в образцах с низким содержанием опухолевой ткани мутации, пропущенные при использовании стандартных подходов.

The subject of the graduate qualification work is «Detection of mutations in KRAS, NRAS, and BRAF genes in samples with a low percentage of tumor cells by digital PCR (dPCR)». In modern lung cancer and colorectal cancer diagnostics an important prognostic factor for treatment is the identification of mutational status in the KRAS, NRAS and BRAF genes. The detection of mutations in these genes can help doctors to adjust patient treatment and prescribe targeted therapy. It is not always possible to detect point mutation substitutions in DNA of samples with a low percentage of tumour tissue by classical methods (Sanger sequencing, allele-specific PCR), so in this study we used a more sensitive method - Digital PCR (dPCR), which allows us to test samples containing only 1-2% tumour tissue. In this study, a test system was established to check for the presence of mutations in 37 frequent cases in the KRAS, NRAS and BRAF genes: its conditions were optimised and primer and sample designs were created. A total of 1919 samples diagnosed with CC and 1566 samples diagnosed with LC were analysed, from which 66 samples of LC and 65 samples of CC without previously identified mutations in KRAS, NRAS, BRAF genes with low percentage of tumour tissue (<10%) were selected. After two-step re-testing by PCR and droplet PCR, mutation status was confirmed in 7 samples, indicating that methods based on digital PCR allow detection of mutations missed by standard approaches in samples with low tumour tissue content.

• СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • 1.1. Мутации генов семейства RAS
  • 1.2. Мутации при колоректальном раке
  • 1.4. Терапевтические подходы к лечению РТК (рака толстой кишки)
  • 1.5. Диагностические методы определения мутаций семейства RAS
    • 1.5.1. HRM (Плавление высокого разрешения)
    • 1.5.2. Аллель-специфическая ПЦР (AsPCR)
    • 1.5.3. Секвенирование по Сэнгеру
    • 1.5.4. Next generation sequencing (NGS)
    • 1.5.5. Цифровая капельная ПЦР
    • 1.5.6. Цифровая ПЦР
  • 1.6. Актуальность, цели и задачи исследования
• ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • 2.1. Подбор праймеров и TaqMan проб
    • 2.1.1. Подбор флюорофоров
      • 2.2. Использование TaqMan пробы для детекции продуктов амплификации
  • 2.3. Материал
  • 2.4. Цифровая ПЦР (цПЦР) Digital PCR (dPCR)
  • 2.5. Цифровая капельная ПЦР Droplet digtal PCR (ddPCR)
    • 2.5.1. Этапы проведения капельной цифровой ПЦР
• ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
  • 3.1. Подбор праймеров и TaqMan проб
  • 3.2. Создание тест-системы
  • 3.3. Выбор образцов
  • 3.4. Анализ образцов при помощи цифровой ПЦР
  • 3.5. Проверка результатов при помощи цифровой капельной ПЦР
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ