Данная работа посвящена исследованию флуоресценции комплекса NADH-ADH, при двухфотонном возбуждении фемтосекундными лазерными импульсами с длинной волны 720 и 840 нм. Целью настоящей работы является выделение сигнала флуоресценции кофермента NADH, находящегося в смеси естественных белков. Для получения экспериментальных сигналов использовалась система счета единичных фотонов с временной корреляцией (TCSPC). В рамках данной работы были проанализированы спектры флуоресценции раствора ADH, полученных при двухфотонном возбуждении на длинах волн 720 и 840 нм. Для анализа химического состава смеси белков была проведена очистка раствора методом хроматографии, в результате которой он был разделен на фракции, и последующий анализ фракций методом масс-спектрометрии. Для фракций, содержащих исследуемый комплекс NADH-ADH, были проведены измерения сигналов затухания флуоресценции спектральных диапазонах 426-446 нм и 460-480 нм при двухфотонном возбуждении на длинах волн 720 и 840 нм. Полученные сигналы затухания флуоресценции были проанализированы с помощью функций суммы 2-х, 3-х и 4-х экспонент, в результате чего были определены следующие параметры: времена жизни флуоресценции и соответствующие им весовые коэффициенты. Было произведено сравнение моделей аппроксимации, в результате чего была выбрана функция, наилучшим образом описывающая сигналы затухания флуоресценции исследуемых фракций. В результате проведенных исследований и анализа полученных данных были обнаружены и идентифицированы примесные белки, находящиеся в растворе ADH, а также успешно выделен сигнал флуоресценции комплекса NADH-ADH с помощью узкополосного интерференционного фильтра.

This work is devoted to the study of the fluorescence of the NADH-ADH complex, under two-photon excitation by femtosecond laser pulses with a wavelength of 720 and 840 nm. The aim of this work is to isolate the fluorescence signal of the biological coenzyme NADH, which is in a mixture of natural proteins. A time-correlated single photon counting system (TCSPC) was used to obtain experimental signals. Within the framework of this work, the fluorescence spectra of the ADH solution at excitation wavelengths of 720 and 840 nm were analyzed. Then the solution was cleaned, as a result of which it was divided into fractions, and subsequent analysis by chromatography and mass spectrometry, respectively. Further, fluorescence attenuation signals of certain fractions were measured at excitation wavelengths of 720 and 840 nm, in the selected fluorescence spectral ranges of 426-446 nm and 460-480 nm. The obtained fluorescence attenuation signals were analyzed using the sum functions of 2, 3 and 4 exponents, as a result of which the following parameters were calculated: fluorescence lifetime and corresponding weighting coefficients. The approximation models were compared to select the best number of exponents for each of the fraction. As a result of the studies and analysis of the data obtained, impurity proteins in the ADH solution were detected and identified, and the NADH fluorescence signal was successfully isolated using a bandpass filter.