Детальная информация

Целью данной работы является изучение влияния сверх-экспрессии фак-тора CHD1 на морфологию Х-хромосомы самцов дрозофилы и локализацию ацетилтрансферазы MOF, изучение влияния сверх-экспрессии ацетилтрансфе-разы MOF на морфологию Х-хромосомы самцов дрозофилы и локализацию фактора CHD1, взаимной локализации CHD1 с ацетилтрансферазой MOF, а также составление протокола проведения иммуноблоттинга для обнаружения белков CHD1 и MOF. Задачи, которые решались в ходе выполнения выпуск-ной квалификационной работы: 1) изучение литературы отечественных и зарубежных источников по вопросам: механизма работы дозовой компенсации у Drosophila melanogaster, хроматин-ремоделирующего фактора CHD1 и ацетилтрансферазы MOF; 2) отработка условий проведения иммуноблоттинга на обнаружение и взаимодействие белков CHD1 и MOF; 3) получение результатов иммуногистохимического анализа, отражаю-щих изменение морфологии Х-хромосомы самцов и привлечения белка CHD1 к ней при повышенной экспрессии этого белка; 4) получение результатов иммуногистохимического анализа, отражаю-щего изменение морфологии Х-хромосомы самцов и привлечение белка CHD1 к ней при повышенной экспрессии белка MOF; 5) получение данных по взаимной локализации фактора сборки и ре-моделирования хроматина CHD1 и ацетилтрансферазы MOF методом непря-мой иммунофлуоресценции. При написании литературного обзора использовались следующие базы  данных: Академия Google, eLIBRARY, PubMed.  Качественную экспериментальных данных, полученных в виде флуорес-центных микрофотографий, осуществляли с использованием программы Ado-be Photoshop. В ходе работы были исследованы паттерны поведения фактора сборки и ремоделирвоания хроматина CHD1 и ацетилстрансферазы MOF, компонента комплекса дозовой компенсации, в условиях нормальной и повышенной их экспрессии у самцов Drosophila melanogaster.  Было установлено, что у особей дикого типа при нормальной экспрессии CHD1 и MOF связываются со специ-фичными для них сайтами связывания на Х-хромосоме самца и в аутосомах (CHD1). Однако при сверх-экспрессии CHD1 ацетилтрансфераза MOF рекру-тируется в эктопические сайты на аутосомах, структура Х-хромосом сильно изменяется: они становятся деконденсированными в районах связывания с CHD1, привлечение MOF нарушается в деконденсированных районах хромо-сом, а при сверх-экспресси MOF наблюдается обратный эффект: MOF вытес-няет CHD1 с Х-хромосомы, и происходит гипер-ацетилирование всех хромо-сом, при этом морфология Х-хромосомы не отличается от строения Х-хромосом особей дикого типа. Выявлено, что изменение в уровне экспрессии белка CHD1 препятствует точному нацеливанию комплекса дозовой компен-сации на Х-хромосому самцов дрозофилы. Также было проведено исследова-ние по детекции белков CHD1 и MOF в белковом экстракте, выделенном из эмбрионов мух дикого типа, методом иммуноблоттинга. В ходе работы было установлено затруднительное выявление белков CHD1 и MOF одновременно на мембране при реализации полусухого и мокрого переноса с ПААГ по при-чине высокого и низкого молекулярного веса белка, для CHD1 и MOF соот-ветственно. Работа была выполнена на базе Лаборатории Экспериментальной Генети-ки ОМРБ «НИЦ Курчатовский институт – ПИЯФ».

The aim of this work is to study the effect of CHD1 or MOF overexpression on the morphology of the X chromosome in Drosophila males, the mutual localization of CHD1 with MOF acetyltransferase, and to develop a protocol for immunoblotting to detect CHD1 and MOF proteins. Tasks that were solved during the final qualifica-tion work: 1) studying the literature of domestic and foreign sources on the following is-sues: the mechanism of dose compensation in Drosophila melanogaster, chromatin-remodeling factor CHD1 and acetyltransferase MOF; 2) development of the conditions for conducting immunoblotting for the detec-tion and interaction of CHD1 and MOF proteins; 3) obtaining the results of immunohistochemical analysis, reflecting the change in the morphology of the X chromosome of males and the attraction of the CHD1 protein to it with an increased expression of this protein; 4) obtaining the results of immunohistochemical analysis, reflecting the change in the morphology of the X chromosome of males and the attraction of the CHD1 protein to it with an increased expression of MOF; 5) obtaining data on the mutual localization of the chromatin assembly and re-modeling factor CHD1 and acetyltransferase MOF by indirect immunofluorescence. When writing the literature review, the following databases were used: Google Academy, eLIBRARY, PubMed. The experimental data obtained in the form of fluorescent micrographs were qualitative processed using the Adobe Photoshop program. In the course of the work, the patterns of behavior of the chromatin assembly are  remodeling factor CHD1 and MOF acetyltransferase, a component of the dose com-pensation complex, were studied under conditions of their normal and increased ex-pression in Drosophila melanogaster males. It was found that in wild-type individu-als with normal expression, CHD1 and MOF bind to their specific binding sites on the male X chromosome and in autosom regions (CHD1). However, when CHD1 is overexpressed, MOF acetyltransferase is recruited to ectopic sites on autosomes, the structure of X chromosomes changes dramatically: they become decondensed, MOF disappears from the decondensed regions, and when MOF is overexpressed, the op-posite effect is observed: MOF displaces CHD1 from the X chromosome , and hy-per-acetylation of all chromosomes occurs, while the morphology of the X chromo-some does not differ from the structure of the X chromosomes of wild-type individ-uals. It was found that changes in the level of expression of CHD1 and MOF pro-teins prevent the precise targeting of the dosage compensation complex to the X chromosome of Drosophila males. A study was also carried out on the detection of CHD1 and MOF proteins in a protein extract isolated from wild-type fly embryos by immunoblotting. In the course of the work, difficult migration of CHD1 and MOF proteins from PAAG to the membrane during semi-dry and wet transfer was estab-lished due to the high and low molecular weight of the protein for CHD1 and MOF, respectively. The work was performed based on the Laboratory of Experimental Genetics of the OMRB "NRC Kurchatov Institute – PNPI".