Детальная информация

Данная работа посвящена исследованию активности нуклеазы ScCas12a в клетках HEK293T. Задачи, которые решались в ходе исследования: - Изучить литературные источники по данной теме; - Создать генетическую конструкцию, несущую нативную последовательность нуклеазы ScCas12a и крРНК; - Создать RNP-комплекс CRISPR-ScCas12a; - Проверить активность нуклеазы ScCas12a в клетках человека. Объект исследования – клетки HEK293T, трансфецированные двумя способами: - Использование плазмиды, которая несёт: ген нативной последовательности Cas12 белка V-A типа, обнаруженного в бактерии Sedimentisphaera cyanobacteriorum, под регуляцией CMV промотора с NLS на концах; последовательность гена EGFP, позволяющего детектировать экспрессию белка in vivo; - Создание RNP-комплекса, состоящего из ScCas12a нативной последовательности нуклеазы и гидовой РНК. Работа выполнена на базе Научно-исследовательского комплекса «Нанобиотехнологий» Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого. При написании литературного обзора использовались следующие базы данных: ScienceDirect, National Center of Biotechnology Information, PubMed Central, FEBS Press, Cyberleninka, Электронная библиотека СПбПУ. Дизайн плазмид и подбор праймеров осуществлялся с использованием онлайн-платформы «Benchling (Benchling, США)». Анализ результатов электрофоретического разделения нуклеиновых кислот производили при помощи программного обеспечения «Imagelab (Bio Rad, США)». В ходе исследования была проверена активность нуклеазы ScCas12a в клетках человека.

The work is dedicated to investigating the activity of ScCas12a nuclease in HEK293T cells. The tasks of the research: - Study the literary sources of the topic; - Create a genetic construct containing the native sequence of ScCas12a nuclease and crRNA; - Create the RNP-complex CRISPR-ScCas12a; - Research of ScCas12a nuclease activity in human cells. - The object of the research is HEK293T cells transfected in two ways: The use of a plasmid that contains: the gene of the native sequence Cas12 V-A type protein found in the bacterium Sedimentisphaera cyanobacterio-rum, under the regulation of a CMV promoter with NLS at the ends; the sequence of the EGFP gene, which allows detecting protein expression in vivo; - Creation of the RNP-complex consisting of ScCas12a native sequence of nuclease and guide RNA. The work was carried out in the analytical center of nano- and biotechnologies of Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University. When writing the literature review, the following databases were used: Sci-enceDirect, National Center of Biotechnology Information, PubMed Central, FEBS Press, Cyberleninka, Polytech Electronic library. Plasmid design and selection of primers was carried out using the online platform Benchling (Benchling, USA). The analysis of the results of electrophoretic separation of nucleic acids was performed using the Imagelab (Bio Rad, USA) software. In the research, ScCas12a nuclease activity was studied in human cells.