Данная работа посвящена получению и характеризации каталитически неактивных эффекторов системы CRISPR/Cas12d1 с помощью внесения миссенс-мутаций в функциональный нуклеазный домен RuvC. Цель работы: получение и характеризация каталитически неактивных эффекторов системы CRISPR/Cas12d1 (CasY1). Задачи, которые решались в ходе исследования: 1. Произведение выравнивания генетических последовательности системы Cas12d1 на известные последовательности Cas12a и Cas12e. Определение функционального     домена системы Cas12d1 и потенциальные мутации, способные привести к утрате им каталитической активности; 2.Моделирование и сборка генетических конструкций системы Cas12d1 с каталитически неактивным нуклеазным доменом; 3.Тестирование белков системы Cas12d1 с каталитически неактивным нуклеазным доменом in vitro. Работа была выполнена в НИК «Нанобио». В результате проделанной работы было показано, что точечные миссенс-мутации D827A и E913A в нуклеазном домене RuvC приводят к образованию мутантных белков dCasY1 D827A и dCasY1 E913A, способных связываться с ДНК-мишенью, однако не разрезающие ее in vitro.

This work is devoted to the preparation and characterization of catalytically inactive effectors of the CRISPR/Cas12d1 system by introducing a missense mutation into the functional nuclease domain RuvC. Objective: to obtain and characterize catalytically inactive effectors of the CRISPR/Cas12d1 (CasY1) system. Tasks that were solved during the study: 1. The product of the alignment of the genetic sequences of the Cas12d1 system by the known sequences Cas12a and Cas12e. Determination of the functional domain of the Cas12d1 system and potential mutations that can lead to the loss of its catalytic activity; 2.Modeling and assembly of genetic constructs of the Cas12d1 system with a catalytically inactive nuclease domain; 3. Testing of Cas12d1 proteins with a catalytically inactive nuclease domain in vitro. The work was carried out in the Scientific research complex "Nanobio". As a result of the work done, it was shown that point missense mutations D827A and E913A in the RuvC nuclease domain lead to the formation of mutant proteins dCasY1 D827A and dCasY1 E913A, capable of binding to the target DNA, but not cutting it in vitro.

• Список использованных сокращений
• Введение
• Глава 1. Обзор литературы
  • 1.1. Устройство и классификация CRISPR-систем
  • 1.2. Механизм работы V типа CRISPR-систем
  • 1.3. Система CRISPR/Cas12a (Cpf1)
  • 1.4. Система CRISPR/Cas12e (CasX)
  • 1.5. Системы CRISPRi и их применение
  • 1.6. Система CRISPR/Cas12d1 (CasY1)
• Глава 2. Методы
  • 2.1. Получение мутантной генетической конструкции dCasY1
    • 2.1.1 Наработка фрагментов гена белка CasY1, содержащих мутации.
    • 2.1.2. Получение плазмиды с мутантной генетической конструкцией dCasY1 D827A / E913A.
    • 2.1.3. Трансформирование плазмиды, содержащей мутантную генетическую конструкцию в штамм Dh5α.
    • 2.1.4 Наработка плазмиды с мутантной генетической конструкцией
    • 2.1.5. Выделение плазмид с мутантными генетическими конструкциями из клеток штамма Dh5α
  • 2.2. Получение мутантных белков dCasY1 D827A и E913A для тестирования in vitro
    • 2.2.1. Трансформирование плазмиды, содержащей мутантную генетическую конструкцию в штамм Rosetta
    • 2.2.2. Наработка биомассы мутантных белков
    • 2.2.3. Выделение мутантных белков из клеточного осадка с помощью соникации
    • 2.2.4. Фильтрация суспензии с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA колонке
    • 2.2.5. Хроматография полученных фракций мутантных белков с помощью гель-фильтрации
  • 2.3. Тестирование мутантных белков in vitro
    • 2.3.1. Проверка направленной связывающей активности
    • 2.3.2. Проверка каталитической активности мутантных белков с помощью агарозного и денатурирующего гелей
• Глава 3. Результаты
  • 3.1. Получение генетической конструкции dCasY1
  • 3.2. Получение белка dCasY1
• Заключение
• Выводы
• Список цитированных источников: