Детальная информация

Данная работа посвящена разработке протоколов определения последовательности и генотипирования различных вариантов коронавируса SARS–CoV–2. Были разработаны протоколы секвенирования последовательности S и N генов методом Сэнгера, а также протокол генотипирования с использованием пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24. В ходе исследования были подобраны пары олигонуклеотидов, отработаны условия ОТ–ПЦР для амплификации выбранных фрагментов генома, подобраны праймеры этапов секвенирования и пиросеквенирования, условия пиросеквенирования (программа, порядок внесения нуклеотидов), и проведена апробация разработанных протоколов. Полученные протоколы позволяют определить полную последовательность S и N генов методом Сэнгера, а также расшифровывать пиросеквенированием участки последовательности S гена, кодирующие замены, характерные для разных вариантов SARS–CoV–2: L18F, T19R, T20N, A67V, Δ69–70, G142D, V213G, D405N, K417N/T, L452R, S477N, T478K, E484A/K/Q, H655Y и др. Разработанная система детекции применяется для секвенирования и генотипирования коронавирусов SARS–CoV–2 при выполнении исследований в отделе вирусологии института экспериментальной медицины.

This study is devoted to the development of protocols for sequencing and genotyping of different variants of the SARS–CoV–2 coronavirus. The developed protocols allow to determine the full–length sequence of S and N genes of SARS–CoV–2 coronovirus by Sanger method and to perform genotyping of the viruses by pyrosequencing with PyroMark Q24 instrument. As a result, pairs of oligonucleotides were selected, reverse transcription PCR conditions for amplification of selected genome fragments were defined, the oligonucleotides for sequencing and pyrosequencing were developed, the pyrosequencing conditions (protocol for the instrument, dispensation order for nucleotides) were set. All developed protocols were tested with genetic material of actual coronavirus strains. The obtained assays provide sequencing of S and N genes, and genotyping protocols allow to perform pyrosequencing of S gene fragments coding numerous substitutions characterizing SARS–CoV–2 variants: L18F, T19R, T20N, A67V, Δ69–70, G142D, V213G, D405N, K417N/T, L452R, S477N, T478K, E484A/K/Q, H655Y, etc. The developed protocols are used for sequencing and genotyping of SARS–CoV–2 strains in the Department of Virology of the Institute of Experimental Medicine.