Существует несколько методов изучения поэтапного биосинтеза белка. Однако большинство из них имеют ряд ограничений и недостатков. В данной работе представлен новый, простой и удобный инструмент для мониторинга поэтапной in vitro трансляции коротких пептидов. Использование BODIPY-меченой инициаторной метионил-тРНК в in vitro системе трансляции позволило визуализировать пошаговый синтез пептидов длиной от одной до семи аминокислот при помощи электрофоретического разделения в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Аминокислотная последовательность визуализированных пептидов была подтверждена при помощи контрольных экспериментов с использованием радиоактивно меченных аминокислот.  Описанный метод помимо мониторинга разных этапов трансляции также позволяет изучать механизмы действия ингибиторов биосинтеза белка, что было подтверждено при помощи контрольных экспериментов с использованием антибиотиков с известными механизмами действия. Разработанный метод позволяет разделять полипептиды в полиакриламидном геле с беспрецедентным разрешением в одну аминокислоту. Также уникальной особенностью разработанной системы является ее сверхвысокая чувствительность с порогом детектирования в области 0,1 пмоль полипептида.

There are several methods for studying stepwise protein biosynthesis. However, most of them have limitations and drawbacks. In this work, we present a novel, simple and convenient tool for monitoring the stepwise in vitro translation of short polypeptides. The use of BODIPY-labeled initiator methionyl-tRNA in an in vitro translation system allowed us to detect the stepwise synthesis of short peptides (from one to seven amino acids in length) by electrophoretic separation in a polyacrylamide gel under denaturing conditions. The amino acid sequence of the visualized peptides was confirmed by control experiments using radioactively labeled amino acids.  In addition to monitoring different translation steps, the method also allows studying the mechanisms of action of protein biosynthesis inhibitors, which was confirmed by control experiments using antibiotics with known mechanisms of action. Developed method allows the separation of polypeptides in a polyacrylamide gel with an unprecedented resolution of one amino acid. Also, the unique feature of the developed system is its ultrahigh sensitivity with a detection threshold in the region of 0.1 pmol of polypeptide.

• 1.1. Трансляция на бактериальной рибосоме
• 1.1.1. Инициация
• 1.1.2. Элонгация
• 1.1.3. Терминация
• 1.2. Методы изучения трансляции
• 1.3. Ингибиторы трансляции
• 1.3.1. Пуромицин
• 1.3.2. Эритромицин
• 1.3.3. Виомицин
• 1.3.4 Мадумицин II
• 1.3.5. Этамицин А
• 2.1. Материалы
• 2.2. Оборудование
• 2.3. Матричные РНК
• 2.4. Электрофоретическое разделение коротких пептидов в полиакриламидном геле в присутствии 7 M мочевины
• 2.5. in vitro трансляция
• 2.6. Сорбция на нитроцеллюлозных фильтрах
• 2.7. Пептидный анализ
• 3.1. Принцип работы системы
• 3.2. Визуализация коротких пептидов в полиакриламидном геле
• 3.3. Флуоресцентная метка не влияет на эффективность in vitro трансляции
• 3.4. Визуализация пептидов в ПААГ разной плотности
• 3.5. Детекция пептидов с различной аминокислотной последовательностью
• 3.6. Влияние ингибиторов биосинтеза белка с известным механизмом действия на синтез коротких пептидов
• 3.7. Ингибиторная активность антибиотика этамицина А
• 3.8. Преимущества разработанного метода
• 3.8.1. Анализ чувствительности метода
• 3.8.2. Синтез флуоресцентной метки