Детальная информация

Данная выпускная квалификационная работа посвящена рациональному дизайну и комплексному исследованию двухмерных (2D) пленочных и трехмерных (3D) пористых матриц на основе хитозана, предназначенных для применения в регенеративной медицине. Целью работы является разработка биосовместимых и биоразлагаемых композитных материалов с контролируемыми механическими свойствами, скоростью деградации и клеточным ответом для использования в тканевой инженерии. Работа выполнена на базе лаборатории "Полимерные материалы для тканевой инженерии и трансплантологии" СПБПУ Петра Великого. Выполнена комплексная характеристика образцов: определены структура, пористость, механические свойства в сухом и увлажненном состоянии, углы смачивания и скорость биодеградации в присутствии фермента лизоцима. Работа показывает, что рационально спроектированные хитозан-гидроксиапатит композиты являются перспективной платформой для создания функциональных биоматериалов для регенерации костной и соединительной тканей.

This bachelor’s thesis is dedicated to the rational design and comprehensive study of two-dimensional (2D) films and three-dimensional (3D) porous matrices based on chitosan, intended for use in regenerative medicine. The objective of the research is to develop biocompatible, bioresorbable composite materials with controlled mechanical properties, degradation rates, and cellular responses suitable for tissue engineering applications. The work was carried out at the Polymer Materials for Tissue Engineering and Transplantology Laboratory at Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University. To enhance the mechanical strength and biological functionality of chitosan-based materials, composites were formulated by incorporating nanosized hydroxyapatite (nHA), a bioceramic known for its osteoconductive and bioactive properties. Overall, the study demonstrates that rationally designed chitosan/nHA composites represent a promising platform for creating advanced biomaterials suitable for skin, bone, and soft tissue regeneration.

• РЕФЕРАТ
• На 81 страницу, 37 рисунков.
• КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ХИТОЗАН, ГИДРОКСИАПАТИТ, ПОЛИМЕРНЫ
• Тема выпускной квалификационной работы: Рациональн
• Данная выпускная квалификационная работа посвящена
• Работа выполнена на базе лаборатории "Полимерные м
• Работа показывает, что рационально спроектированны
• ABSTRACT
• 81 pages, 37 figures.
• KEYWORDS: CHITOSAN, HYDROXYAPATITE, SCAFFOLD, TISS
• The subject of the graduate qualification work is
• This bachelor’s thesis is dedicated to the rationa
• The work was carried out at the Polymer Materials
• Overall, the study demonstrates that rationally de
• СОДЕРЖАНИЕ
  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УС
  • ВВЕДЕНИЕ
  • ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТ
  • 1.1. Понятие о рационал
  • 1.2. Тканевая инженери
  • 1.3. Свойства материало
  • 1.4. Хитозан
  • 1.5. Композиты и наноч
  • 1.6. Механическая стим
  • ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И М
  • 2.1. Материалы
  • 2.1.1. Хитозан
  • 2.1.2 Гидроксиапатит
  • 2.1.3. Растворители ки
  • 2.1.4. Композитные дву
  • 2.1.5. Композитные тре
  • 2.1.6. Культура клеток
  • 2.1.7. Фосфатно-буферны
  • 2.2. Методы исследован
  • 2.2.1. Методика синтез
  • 2.2.2. Методика синтез
  • 2.2.3. Механические исп
  • 2.2.4. Механические ис
  • 2.2.5. Измерение краево
  • 2.2.6. Исследование ре
  • 2.2.7. Электронная мик
  • 2.2.8. Культивирование
  • 2.2.9. Методика исслед
  • 2.2.10. Методика прове
  • 2.2.11. Флуоресцентная
  • ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И
  • 3.1. Результаты исслед
  • 3.1.1. Механические ис
  • 3.1.2. Механические исп
  • 3.1.3. Краевой угол сма
  • 3.1.4. Биодеструкция
  • 3.1.5. Сканирующая эле
  • 3.1.6. Результаты МТТ-т
  • 3.1.7. Результаты меха
  • 3.2. Результаты исслед
  • 3.2.1. Механические ис
  • 3.2.2. Сканирующая эле
  • 3.2.3. Результаты МТТ-
  • 3.2.4. Флуоресцентная
  • ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  • СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ
• СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
  • DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium
  • E – модуль упругости
  • FBS – фетальная бычья сыворотка
  • ε – деформация при растяжении
  • σ – прочность
  • ГА – гидроксиапатит
  • ДМСО – диметилсульфоксид
  • ЛЗЦ – лизоцим
  • ММ – молекулярная масса
  • МСК – это мезенхимальные стромальные (стволовые) к
  • МТТ – тиазолиловый синий тетразолий-бромид
  • нГА – наночастицы гидроксиапатита
  • СД – степень деацетилирования
  • СЭМ – сканирующая электронная микроскопия
  • ФБР – фосфатно-буферный раствор
  • ХАН – хитозан
• ВВЕДЕНИЕ
  • Разработка эффективных материалов для регенеративн
  • Ключевым элементом в тканевой инженерии является б
  • Среди природных полимеров особый интерес представл
  • Настоящая работа посвящена рациональному дизайну и
  • Целью данной работы являлось создание и исследован
  • В рамках поставленной цели были определены следующ
  • 1)разработать и реализовать методы получения двумерн
  • 2)провести исследование механических свойств получен
  • 3)изучить физико-химические свойства материалов, вкл
  • 4)разработать и реализовать план клеточных исследова
  • 5)оценить влияние формы, состава и условий механичес
• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • 1.1. Понятие о рациональном дизайне
    • Рациональный дизайн (от англ. rational design) – э
    • В тканевой инженерии рациональный дизайн представл
    • Основой проектирования служит информация о типе за
    • Такой подход позволяет не только адаптировать свой
  • 1.2. Тканевая инженерия
    • Тканевая инженерия представляет собой современное
    • Широкое применение тканевая инженерия находит в та
    • Тканевая инженерия предлагает альтернативу: возмож
    • Процесс создания тканеинженерных конструкций включ
    • 1.рациональный дизайн тканеинженерной конструкции с
    • 2.разработку биосовместимых и биоразрушаемых материа
    • 3.культивирование клеток и формирование тканей in vi
    • 4.последующую имплантацию конструкций пациенту.
    • Основные задачи тканевой инженерии – обеспечение э
    • Одним из подходов является использование стволовых
    • После внедрения конструкция должна сохранять свои
  • 1.3. Свойства материалов для тканевой инженерии
    • Для тканеинженерных матриц предъявляется ряд ключе
    • Все перечисленные характеристики определяются выбо
    • На сегодняшний день широкое применение получили по
    • Одним из ключевых параметров таких матриц является
    • В последние годы в разработке матриц все чаще прим
    • Совмещение биодеградируемости с высокой прочностью
    • Особый интерес вызывают природные полисахариды, та
  • 1.4. Хитозан
    • Хитозан представляет собой линейный полисахарид пр
    • Одним из ключевых параметров, определяющих свойств
    • Кроме СД, важной характеристикой хитозана является
    • Современные исследования показывают, что скорость
    • Хитозан может существовать в двух химических форма
    • Такие взаимодействия важны для создания композитны
    • Кроме того, было показано, что увеличение СД приво
    • Таким образом, варьируя молекулярную массу и степе
  • 1.5. Композиты и наночастицы гидроксиапатита
    • Благодаря исследованию физико-химических и механич
    • Несмотря на перечисленные преимущества, применение
    • Одним из эффективных путей улучшения свойств хитоз
    • Гидроксиапатит (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) является основным
    • Гидроксиапатит, как природный компонент костной тк
    • Важно отметить, что наряду с улучшением эксплуатац
    • Особое внимание в современных исследованиях уделяе
  • 1.6. Механическая стимуляция
    • Механотрансдукция представляет собой фундаментальн
    • Физические стимулы, воздействующие на клетки, могу
    • Однако при нарушении регуляции механотрансдукции в
    • Процессы заживления хронических ран и формирование
    • С этой точки зрения особую актуальность приобретае
    • Интерактивные повязки нового поколения должны выпо
    • Следует учитывать, что кожа как орган обладает сло
    • Интеграция механостимулирующих свойств в дизайн ра
    • Целью данной работы являлось создание и исследован
    • В рамках поставленной цели были определены следующ
    • 6)осуществить выбор оптимальных марок и типов хитоза
    • 7)разработать и реализовать методы получения двумерн
    • 8)провести исследование механических свойств получен
    • 9)изучить физико-химические свойства материалов, вкл
    • 10)разработать и реализовать план клеточных исследова
    • 11)оценить влияние формы, состава и условий механичес
    • 12)на основе полученных данных выделить наиболее перс
• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  • 2.1. Материалы
    • В данной работе в качестве объектов исследования
    • 2.1.1. Хитозан
      • Хитозан представляет собой линейный полукристаллич
      • Рисунок 2.1 – Химическая структура молекулы хитоза
      • Выбор поставщика хитозана играет ключевую роль при
    • 2.1.2 Гидроксиапатит
      • Гидроксиапатит кальция (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) – это сла
      • В результате взаимодействия водных растворов гидро
    • 2.1.3. Растворители кислотной природы
      • В данной работе для приготовления пленочных двумер
      • Молочная кислота (CH₃CH(OH)COOH) представляет собо
      • Янтарная кислота (C₄H₆O₄), или бутандиовая кислота
      • На этапе разработки пористых губчатых материалов б
    • 2.1.4. Композитные двумерные материалы
      • Основным объектом на начальных этапах исследования
    • 2.1.5. Композитные трехмерные материалы
      • Большая часть экспериментов с клеточными культурам
      • Но на данном этапе многие эксперименты in vitro по
    • 2.1.6. Культура клеток
      • Различные типы клеток человека находят применение
      • Тем не менее, наиболее часто в лабораторных услови
      • 1)простота культивирования данных клеток;
      • 2)фибробласты формируют основную структурную матрицу
      • 3)они создают специфические условия микросреды, спос
      • 4)при культивировании in vitro фибробласты сохраняют
      • 5)на данный момент не существует другой универсально
      • 6)любые изменения, происходящие при культивировании
      • В настоящем исследовании для оценки биосовместимос
    • 2.1.7. Фосфатно-буферный раствор и лизоцим
      • Хитозан и его производные деградируют в организме
      • Исследование резорбции материалов in vitro проводи
  • 2.2. Методы исследования
    • 2.2.1. Методика синтеза двумерных материалов
      • Изготовление пленочных материалов включало последо
      • На первом этапе наночастицы гидроксиапатита диспер
      • После диспергирования в полученную водную суспензи
      • После завершения перемешивания раствор фильтровали
      • Формирование пленок осуществляли методом разлива н
      • Для перевода пленок в нерастворимую форму осуществ
      • Толщина пленок была измерена при помощи цифрового
    • 2.2.2. Методика синтеза трехмерных материалов
      • В отличие от ранее описанного метода получения пле
      • Для получения исходных растворов использовали 4–5%
      • Наночастицы гидроксиапатита предварительно дисперг
      • Готовые растворы с заданной концентрацией нГА (0;
      • После завершения этапа сушки пористые образцы комп
      • Одним из преимуществ данной методики является возм
    • 2.2.3. Механические испытания в воздушной среде
      • Испытание механических свойств изготовленных плено
      • Испытание на растяжение – это простой и широко исп
      • В процессе испытаний регистрировалась диаграмма ра
      • Каждое значение представляет собой среднее арифмет
    • 2.2.4. Механические испытания в жидкой среде
      • В дополнение к испытаниям в сухом состоянии (см. в
      • Испытания проводились с использованием биомеханиче
      • Параметры испытаний:
      • 1)Тип нагрузки: одноосное растяжение в среде ФБР
      • 2)Начальная длина образца: 10 мм
      • 3)Скорость растяжения: 5 мм/мин
      • 4)Максимальное удлинение: 100%
      • Полученные данные позволяют оценить, насколько мат
      • Кроме одноразового растяжения, камера Biss Ligagen
      • Параметры циклирования:
      • 1)Тип нагрузки: циклическое одноосное растяжение
      • 2)Амплитуда деформации: ±1 мм
      • 3)Частота: 0,5 Гц
      • 4)Общее время испытания: 24 часа
      • Эта методика особенно полезна для оценки материало
    • 2.2.5. Измерение краевого угла смачивания
      • Контактным углом называют угол, образующийся на ст
      • Краевой угол смачивания для композитных пленок на
    • 2.2.6. Исследование резорбции материалов in vitro
      • Для оценки резорбции образцов применялась модельна
      • Эксперимент проводился в двух типах сред:
      • 1)Контрольная среда – фосфатно-буферный раствор (ФБР
      • 2)Испытательная среда – ФБР, содержащий лизоцим в ко
      • Образцы инкубировали в СО2-инкубаторе 8000 WJ (The
      • Для поддержания стабильной активности лизоцима, ра
      • Для оценки стабильности лизоцима в растворе после
      • Образцы растворов, в которых инкубировались образц
    • 2.2.7. Электронная микроскопия
      • Морфология исследуемых образцов изучалась с исполь
      • 1)поверхности исходных материалов;
      • 2)сколов образцов, полученных при криогенном разруше
      • 3)поверхности материалов после культивирования фибро
      • СЭМ-анализ применялся с целью детального изучения
      • Перед анализом образцы были подвергнуты стандартно
      • СЭМ-исследования проводились на электронном микрос
      • Для анализа взаимодействия клеток с материалом пос
    • 2.2.8. Культивирование клеток
      • Культивирование клеток проводили в стерильных усло
      • Культивирование дермальных фибробластов
      • Культуру дермальных фибробластов кожи человека вел
      • Достижение 80–90% конфлюентности служило сигналом
      • Культивирование мезенхимальных стромальных клеток
      • МСК культивировали в питательной среде α-MEM (Ther
      • Культивирование макрофагов
      • Для получения макрофагов из моноцитов крови челове
      • Жизнеспособность и морфологические характеристики
    • 2.2.9. Методика исследования биосовместимости
      • На следующем этапе проводили стерилизацию образцов
      • Через 2 часа после посева осуществляли микроскопич
      • Далее в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл р
      • Оптическую плотность растворов регистрировали при
      • Для обработки результатов и построения графиков ис
    • 2.2.10. Методика проведения механической стимуляци
      • В рамках настоящего исследования проводилась механ
      • Пленки нарезали на прямоугольные образцы размером
      • Перед механической стимуляцией клетки (МСК, фиброб
      • Механическая стимуляция проводилась в инкубаторе с
      • Образцы с прикрепленными клетками помещались в заж
      • 1)Статическое растяжение. Одноосная деформация до 10
      • 2)Динамическая (циклическая) нагрузка. Применялась п
      • Испытания проводились в физиологически смоделирова
      • Регистрация параметров нагрузки, деформации и хода
    • 2.2.11. Флуоресцентная микроскопия
      • Оценку взаимодействия клеток с различными материал
      • Материалы предварительно стерилизовали и помещали
      • В качестве модельных клеток использовались человеч
      • 1)Клетки, экспрессирующие зеленый флуоресцентный бел
      • 2)Клетки, меченные флуоресцентным красителем PKH26:
      • Перед нанесением на образцы клетки предварительно
      • После подготовки клеточного материала, клетки нано
      • Наблюдение за клетками проводилось с помощью флуор
      • Полученные изображения анализировались с использов
      • 1)наличие и распределение клеток на поверхности обра
      • 2)морфология клеток (вытянутость, площадь распростра
      • 3)степень проникновения клеток в пористую структуру
      • 4)плотность прикрепленных клеток и выраженность клет
• ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
  • 3.1. Результаты исследования двумерных материалов
    • 3.1.1. Механические испытания в воздушной среде
      • В рамках установленных задач были изучены механиче
      • Полученные данные показали, что добавление наночас
      • При увеличении содержания гидроксиапатита до 1 мас
      • На основании полученных результатов можно заключит
    • 3.1.2. Механические испытания в жидкой среде
      • Испытания проводились с использованием биомеханиче
      • Результаты испытаний представлены на Рисунке 3.2.
      • Повышение содержания гидроксиапатита до 1 мас.% вн
      • Таким образом, полученные данные демонстрируют, чт
    • 3.1.3. Краевой угол смачивания
      • На Рисунке 3.3 представлена зависимость контактног
      • Полученные результаты позволяют предположить, что
    • 3.1.4. Биодеструкция
      • Необходимым условием успешного применения композит
      • На рисунке 3.4 приведена оптическая плотность фосф
      • Калибровочные стандарты:
      • 1)a – ФБР+ЛЗЦ, разбавленный дистиллированной водой в
      • 2)b – ФБР+ЛЗЦ, разбавленный дистиллированной водой в
      • 3)c – ФБР+ЛЗЦ, разбавленный дистиллированной водой в
      • Содержание лизоцима в растворе сохраняется постоян
      • Во время эксперимента, результаты которого предста
      • Интересный эффект был зафиксирован в промежуток с
      • Можно предположить, что повышение массы образцов в
      • Таким образом, исследование подтвердило, что компо
    • 3.1.5. Сканирующая электронная микроскопия
      • Для оценки морфологии поверхности и внутренней стр
      • Анализ сколов образцов, полученных при замораживан
    • 3.1.6. Результаты МТТ-теста
      • Для оценки цитосовместимости разработанных пленочн
      • На первом этапе спустя сутки была проведена оценка
      • На Рисунке 3.9 представлены микрофотографии фиброб
      • На четвертые сутки культивирования была проведена
      • Анализ результатов МТТ-теста показал (Рисунок 3.11
      • Полученные данные позволяют заключить, что исследу
    • 3.1.7. Результаты механостимуляции
      • В ходе исследования были проведены эксперименты по
      • Параметры механической стимуляции подбирались с уч
      • Результаты визуализированы с использованием флуоре
      • Фибробласты человека (Рисунок 3.12). После механич
      • МСК человека (Рисунок 3.13). Также было отмечено в
      • Макрофаги (Рисунок 3.14). До и после стимуляции бы
      • Изменения в морфологии и пространственном распреде
      • Полученные данные планируется воспроизводить в рас
      • Таким образом, полученные результаты демонстрируют
  • 3.2. Результаты исследования трехмерных материалов
    • 3.2.1. Механические испытания в жидкой среде
      • Оценка механических характеристик пористых материа
      • Испытания проводились в буферном растворе с исполь
      • Замечено, что губки, осажденные с использованием с
      • Полученные результаты представлены в виде диаграмм
      • На основании анализа полученных диаграмм установле
      • Образцы, изготовленные с применением янтарной кисл
      • В противоположность этому, губки, полученные с исп
      • Таким образом, материалы на основе янтарной кислот
      • Следует также отметить, что образцы с содержанием
      • Наибольший интерес с точки зрения механических хар
    • 3.2.2. Сканирующая электронная микроскопия
      • Размер пор – это расстояние между твердыми секциям
      • Установлено, что поры в структуре имеют размеры от
      • Вместе с тем, показано, что выбор типа осадителя о
      • Дополнительно, на одном из микроснимков был визуал
    • 3.2.3. Результаты МТТ-теста
      • Из-за различий структуры губки имеют разную площад
      • Вытяжки получали путем проведения экстракции иссле
      • Клетки высаживали на культуральный 24‑луночный пла
      • Анализ результатов МТТ-теста показал, что все иссл
    • 3.2.4. Флуоресцентная микроскопия
      • Флуоресцентная микроскопия была применена для визу
      • Полученные изображения с масштабной линейкой в 100
      • Первичное исследование на цитотоксичность и методо
      • Следующим этапом планируется интеграция механическ
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
  • Данная работа была посвящена разработке, изготовле
  • Полученные результаты позволяют сделать следующие
  • 1.В рамках исследования была разработана методика по
  • 2.Комплексное исследование механических характеристи
  • 3.Поверхностные свойства композитов также были тщате
  • 4.Биосовместимость композитов была подтверждена в эк
  • 5.Дополнительное внимание было уделено влиянию механ
  • Актуальность исследования заключается в комплексно
• СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
  • 1.Волова, Т. Г. Материалы для медицины, клеточной и
  • 2.Mao, S., Shuai, X., Unger, F., Simon, M., Bi, D.,
  • 3.Idris, N. K., Aziz, N. N., Zambri, M. S. M., Zakar
  • 4.Wang, W., Meng, Q., Li, Q., Liu, J., Zhou, M., Jin
  • 5.Kurita, K. Chitin and chitosan: functional biopoly
  • 6.Silva, S. S., Popa, E. G., Gomes, M. E., Silva, T.
  • 7.Pereira, A., Gomes, M. E., Ribeiro, A. Recent Adva
  • 8.Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and ap
  • 9.Kumar, M. N. V. R. A review of chitin and chitosan
  • 10. Zhou, H., Lee, J. Nanoscale hydroxyapatite partic
  • 11. Wang, W., et al. Hydroxyapatite nanoparticles pro
  • 12. Zhang, Y., et al. High-speed rotational mixing fo
  • 13. Jansen, L. E., et al. Mechanics of intact bone ma
  • 14. Li, Z., et al. Chitosan-based nanocomposite membr
  • 15. Chaudhuri, O., et al. The role of mechanotransduc
  • 16. Shakir, S., et al. Mechanotransduction pathways i
  • 17. Zulkifli, F. H., Hussain, F. S. J., Zeyohannes, S
  • 18. Zhou, Y., et al. Fibroblast mechanotransduction i
  • 19. Aarabi, S., et al. Mechanical load initiates hype
  • 20. Hinz, B. Formation and function of the myofibrobl
  • 21. Zhang, J., et al. High-shear homogenized chitosan
  • 22. Park, K. S., et al. Mechanical durability and bio
  • 23. Flynn, C., et al. Viscoelastic properties of huma
  • 24. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of
  • 25. Волоскова, Е. В., Полубояров, В. А., Горбунов, Ф.
  • 26. Das, S., Baker, A. B. Biomaterials and nanotherap