Детальная информация

Работа посвящена исследованию влияния количества сайтов рестрикции системы рестрикции-модификации CfrBI, закодированных в геноме бактериофага λ, на дальнейшее инфицирование данным фагом бактерий рода Escherichia coli. Задачи, которые решались в рамках исследования: − моделирование генетических конструкций плазмидных векторов и фага λ с различным числом сайтов рестрикции системы CfrBI в программе SnapGene; − сборка CRISPR-Cas системы для направленного редактирования генома бактериофага λ; − проведение идентификации отредактированных бактериофагов методом секвенирования по Сэнгеру. Объект исследования: геном бактериофага λ, система рестрикции-модификации CfrBI, плазмидные векторы для CRISPR-Cas редактирования. Работа выполнена на базе лаборатории НИК «Нанобиотехнологии» Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого. Анализируемыми параметрами были количество сайтов рестрикции 5-CCWWGG-3 в геноме фага λ, эффективность сборки CRISPR-Cas конструкций, результаты титрования фага до и после редактирования, резистентность выделенных штаммов E. coli к фаговой инфекции. В ходе исследования установлено, что: − направленное редактирование генома фага λ системой CRISPR-Cas позволило сократить число сайтов рестрикции CfrBI с 4 до 3; − бактерии E. coli, кодирующие систему R-M, продемонстрировали повышенный уровень резистентности к инфицированию бактериофагом λ после его редактирования. Для достижения данных результатов в работе были использованы следующие информационные технологии: SnapGene для моделирования генетических конструкций; базы данных NCBI, GenBank для анализа нуклеотидных последовательностей, PubMed и eLIBRARY.ru для написания литературного обзора; облачные хранилища Google Drive и Microsoft 365.

This research investigates the impact of CfrBI restriction sites number in the λ bacteriophage genome on the efficiency of Escherichia coli strains infection. Tasks that were solved within the course of the research: − plasmid vectors and λ phage genome modeling with different numbers of CfrBI restriction sites using SnapGene software; − assembly of the CRISPR-Cas system for target editing of the λ phage genome; − validation of phage genome modifications via Sanger sequencing. Object of study: λ bacteriophage genome, CfrBI restriction-modification system, plasmid vectors for CRISPR-Cas editing. The work was carried out at the laboratory of the research complex “Nanobiotechnology” of St. Petersburg Peter the Great Polytechnic University. The analyzed parameters were the restriction number sites 5-CCWWWGG-3 in the phage λ genome, the efficiency of CRISPR-Cas construct assembly, the results of phage titration before and after editing, and the resistance of isolated E. coli strains to phage infection. The study found that: − direct editing of the phage λ genome by the CRISPR-Cas system reduced the number of CfrBI restriction sites from 4 to 3. − E. coli bacteria coding R-M system presented the increased resistance level to λ phage infection after its editing. To achieve the results, the following information technologies were used in this work: SnapGene for genetic constructions modeling; NCBI, GenBank databases for nucleotide sequence analysis, PubMed and eLIBRARY.ru for writing the literature review; cloud storage Google Drive and Microsoft 365.

• СОДЕРЖАНИЕ
• ВВЕДЕНИЕ
• 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
• 1.1. Системы защиты бактерий от бактериофагов
• 1.2. Экологическая и биологическая роль защитных систем
• 1.3. Классификация систем
• 1.3.1. Система CRISPR-Cas
• 1.3.2. Системы рестрикции-модификации
• Системы R-M типа II
• Система рестрикции-модификации СfrBI
• 1.4. Бактериофаги
• 1.4.1. Общая характеристика бактериофагов
• 1.4.2. Бактериофаг λ
• 1.4.3. Стратегии обхода фагом защитных систем бактерий
• 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
• 2.1. Метод редактирования генома фага λ
• 2.1.1. Плазмидные векторы и бактериальные культуры
• 2.1.2. Питательные среды
• 2.1.3. Полимеразная цепная реакция
• 2.1.4. Трансформация бактерий E. coli плазмидными векторами
• Химическая трансформация бактерий
• Электротрансформация плазмидных векторов
• 2.1.5. Cборка генетической конструкции, кодирующей систему CRISPR-Cas
• Вектор sgRNA
• Вектор MatrixRecomb
• 2.1.6. Редактирование генома фага λ технологией CRISPR-Cas
• 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ