Детальная информация

Данная работа посвящена исследованию высокочувствительного метода детекции микроРНК-21-5p, играющей важную роль в регуляции экспрессии генов и ассоциированной с рядом заболеваний, включая онкологические. Основная сложность в детекции miRNA связана с их малым размером (около 22 нуклеотидов), что ограничивает применение стандартных методов амплификации. В исследовании предложен подход, основанный на лигировании ДНК-олигонуклеотидов, комплементарных miRNA-21-5p, с последующей амплификацией полученной ДНК-матрицы методом ПЦР в реальном времени. Ключевым элементом метода является использование рекомбинантной ДНК-лигазы PBCV-1, обладающей высокой эффективностью в лигировании гибридных ДНК-РНК дуплексов. Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи: • проведен подбор оптимальных пар ДНК-олигонуклеотидов, комплементарных miRNA-21-5p, и оценена их способность к образованию стабильных гибридных комплексов; • оптимизированы условия ферментативного лигирования, включая концентрацию лигазы, температурный режим, время инкубации и состав буферных систем. Проведена оценка качества лигирования методом гель-электрофореза; • выполнено сравнительное тестирование эффективности лигаз SplintR (New England Biolabs, США) и April (Алкор Био, РФ) при образовании ДНК-матриц; • оценена специфичность детекции miRNA-21-5p методом real-time ПЦР с использованием различных пар праймеров и интеркалирующего красителя Eva Green. В результате исследований были подобраны пары ДНК-олигонуклеотидов для лигирования A12-B10 и A11-B11 (Алкор Био, РФ), обеспечивающие эффективное соединение комплементарных участков с miRNA-21-5p. Сравнение эффективности лигирования показало, что отечественная ДНК-лигаза April (Алкор Био, РФ) демонстрировала сопоставимые результаты с коммерческим аналогом SplintR (NEB, США). Наибольшая чувствительность детекции miRNA-21-5p достигнута при использовании праймеров А4 (Алкор Био, РФ), что подтверждает перспективность разработанного метода для молекулярной диагностики. При подготовке литературного обзора использовались базы данных PubMed, Scopus, eLibrary, Web of Science. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программного обеспечения для анализа данных электрофореза (ImageLab) и ПЦР (CFX Maestro Software).

This study focuses on the development of a highly sensitive method for detecting microRNA-21-5p, which plays a crucial role in gene expression regulation and is associated with various diseases, including cancer. The primary challenge in miRNA detection lies in their small size (~22 nucleotides), which limits the application of standard amplification methods. The proposed approach is based on the ligation of DNA oligonucleotides complementary to miRNA-21-5p, followed by amplification of the resulting DNA template using real-time PCR. A key element of the method is the use of recombinant PBCV-1 DNA ligase, which exhibits high efficiency in ligating DNA-RNA hybrid duplexes. To achieve this goal, the following tasks were addressed: • Selection of optimal pairs of DNA oligonucleotides complementary to miRNA-21-5p and evaluation of their ability to form stable hybrid complexes. • Optimization of enzymatic ligation conditions, including ligase concentration, temperature regime, incubation time, and buffer composition. Ligation efficiency was assessed by gel electrophoresis. • Comparative testing of the ligation efficiency of SplintR ligase (New England Biolabs, USA) and April ligase (Alkor Bio, Russia) in DNA template formation. • Evaluation of the specificity of miRNA-21-5p detection using real-time PCR with different primer pairs and the intercalating dye Eva Green. The study identified DNA oligonucleotide pairs (A12-B10 and A11-B11, Alkor Bio, Russia) that ensure efficient ligation of complementary regions with miRNA-21-5p. Comparative analysis revealed that the domestic April DNA ligase (Alkor Bio, Russia) demonstrated performance comparable to the commercial counterpart SplintR (NEB, USA). The highest detection sensitivity for miRNA-21-5p was achieved using primer set A4 (Alkor Bio, Russia), confirming the potential of the developed method for molecular diagnostics. The literature review was conducted using PubMed, Scopus, eLibrary, and Web of Science databases. Statistical data analysis was performed using specialized software for electrophoresis (ImageLab) and PCR (CFX Maestro Software).