Детальная информация

Данная работа посвящена изучению потенциала применения ревертазы вируса лейкемии мышей M-MuLV, разрабатываемой на предприятии «Алкор Био» для детекции микроРНК методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием stem-loop праймеров. Целью данного исследования являлась оценка каталитической активности M-MuLV ревертаз при работе с короткими микроРНК-21-5р-матрицей, предварительно увеличенной в длине с помощью метода stem-loop, и оптимизация условий проведения обратной транскрипции для повышения чувствительности и специфичности ОТ-ПЦР. В ходе работы был проведен сравнительный анализ эффективности использования различных форм коммерческих ревертаз M-MuLV (Биолабмикс, РФ и Vazyme, КНР) для копирования микрорнк матрицы. Кроме того была установлена степень влияния различных компонентов реакционной смеси на эффективность детекции кДНК копий микрорнк методом ПЦР в реальном времени. Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи: Произведён подбор stem-loop праймеров для удлинения микроРНК-21-5р. Проведен сравнительный анализ эффективности обратной транскрипции тотальной РНК человека и микроРНК-21-5p с использованием коммерческих  (Биолабмикс и Vazyme) и разрабатываемой в настоящее время (Алкор Био, РФ) ревертаз. Оценена возможность последующей детекции полученных кДНК методом количественной ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР). Установлено влияние различных буферных систем на эффективность образования кДНК с матрицы микроРНК-21-5р ревертазой (Алкор Био). Определена эффективность реакции ОТ-ПЦР при различной  концентрации матрицы микроРНК-21-5р  ревертазой «Биолабмикс». В результате исследований  доказана потенциальная возможность использования  вариантов отечественных ревертаз (Алкор Био, РФ и Биолабмикс, РФ) для детекции микроРНК человека. Экспериментально подтверждено, что метод stem-loop, необходимый при увеличения длины микроРНК-матрицы обеспечивает принципиальную возможность её детекции в ходе ПЦР в реальном времени.  Было установлено, что ревертаза M-MuLV от лаборатори «Алкор Био» на данном этапе не является коммерческим продуктом и требует дальнейшей оптимизации для повышения функциональной активности. Экспериментальные данные подтверждают незначительное влияние компонентов стандартных буферных систем на активность этой ревертазы. Доказано, что повышение концентрации матрицы увеличивает точность определения микроРНК-21-5р  методом ОТ-ПЦР в реальном времени с помощью ревертазы «Биолабмикс». Поэтому, проведение аналогичного эксперимента целесообразно для увеличения чувствительности детекции микроРНК ревертазой «Алкор Био». При подготовке литературного обзора использовались базы данных PubMed, Scopus, eLibrary, ScienceDirect, Web of Science. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программного обеспечения для анализа ПЦР (CFX Maestro Software).

This work is devoted to studying the potential of using the revertase of the murine leukemia virus M-MuLV, developed at the Alkor Bio enterprise for detecting microRNA by the RT-PCR method in real time using stem-loop primers. The aim of this study was to evaluate the catalytic activity of M-MuLV reverse transcriptases when working with short microRNA-21-5p templates, previously increased in length using the stem-loop method, and to optimize the conditions for reverse transcription to increase the sensitivity and specificity of RT-PCR. In the course of the work, a comparative analysis of the efficiency of using various forms of commercial M-MuLV reverse transcriptases (Biolabmix, Russia and Vazyme, China) for copying the microRNA matrix was carried out. In addition, the degree of influence of various components of the reaction mixture on the efficiency of detecting cDNA copies of microRNA by real-time PCR was established. To achieve this goal, the following tasks were solved: A selection of stem-loop primers was made to extend microRNA-21-5p. A comparative analysis of the efficiency of reverse transcription of total human RNA and microRNA-21-5p using commercial (Biolabmix and Vazyme) and currently being developed (Alcor Bio, Russian Federation) reverse transcriptases was performed. The possibility of subsequent detection of the obtained cDNAs by quantitative real-time PCR (RT-PCR) was assessed. The effect of various buffer systems on the efficiency of cDNA formation from the microRNA-21-5p template by reverse transcriptase (Alcor Bio) was established. The efficiency of the RT-PCR reaction at different concentrations of the microRNA-21-5p template by Biolabmix reverse transcriptase was determined. The research proved the potential possibility of using variants of domestic reverse transcriptases (Alcor Bio, Russian Federation and Biolabmix, Russian Federation) for detecting human microRNA. It was experimentally confirmed that the stem-loop method, necessary when increasing the length of the microRNA template, provides a fundamental possibility of its detection during real-time PCR. It was found that the M-MuLV reverse transcriptase from the Alkor Bio laboratory is not a commercial product at this stage and requires further optimization to increase its functional activity. Experimental data confirm the insignificant effect of the components of standard buffer systems on the activity of this reverse transcriptase. It has been proven that an increase in the matrix concentration increases the accuracy of determining microRNA-21-5p by real-time RT-PCR using the Biolabmix reverse transcriptase. Therefore, it is advisable to conduct a similar experiment to increase the sensitivity of microRNA detection by the Alkor Bio reverse transcriptase. The following databases were used in preparing the literature review: PubMed, Scopus, eLibrary, ScienceDirect, Web of Science. Statistical data processing was performed using PCR analysis software (CFX Maestro Software).

• ВВЕДЕНИЕ
• 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • 1.1. МикроРНК
  • 1.2. Механизм ПЦР
  • 1.3. Методы детекции микроРНК
    • 1.3.1. Метод stem-loop
    • 1.3.2. Механизм метода stem-loop
    • 1.3.3. Преимущества метода stem-loop
  • 1.4. Ревертазы
    • 1.4.1. Механизм действия
    • 1.4.2. Основные типы ревертаз
    • 1.4.3. Структура ревертазы M-MuLV RT
    • 1.4.4. Значимость ревертазы M-MuLV
  • 1.5. Ингридиенты ПЦР
    • 1.5.1. ДНК-матрица
    • 1.5.2. ДНК-полимераза
    • 1.5.3. Праймеры
    • 1.5.4. Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP’s)
    • 1.5.5. Ионы магния (Mg2+)
    • 1.5.6. Буферная среда
• 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • 2.1. Объекты и предметы исследования
    • 2.1.1. Ревертазы M-MuLV и буферные системы
    • 2.1.2. МикроРНК-21-5р и тотальная РНК человека
    • 2.1.3. Олигонуклеотиды
    • 2.1.4. ПЦР смесь
  • 2.2. Методика выполнения эксперимента
    • 2.2.1. Подготовка смесей
    • 2.2.2. Проведение ОТ-ПЦР
    • 2.2.3. Проведение ПЦР в реальном времени
    • 2.2.4. Критерии эффективной работы фермента
  • 2.3. Схема исследования
• 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
  • 3.1. Сравнительный анализ эффективности наработки кДНК с матрицы тотальной РНК
  • 3.2. Определение результативности ревертаз при наработке кДНК с матрицы микроРНК-21-5р
  • 3.3. Установление степени влияния буферных систем на эффективность синтеза кДНК исследуемой ревертазой
  • 3.4. Оценка влияния количества матрицы микроРНК-21-5р на эффективность наработки кДНК
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ