Детальная информация

Целью данной работы была характеризация коллатеральной активности системы CRISPR-ScCas12a из бактерии  S. cyanobacteriorum, и выявление степени ее специфичности путем сравнения с широко описанным белком AsCas12a из бактерии Acidaminococcus sp. Исследование уровня специфичности системы проводилось методом измерения  интенсивности световых потоков, возникающих вследствие индуцированного коллатеральной активностью  нуклеазного расщепления одноцепочечных флуоресцентных ДНК репортеров после направленного разрезания комплексами CRISPR-ScCas12a ДНК мишеней. В исследовании использовались специфичные ДНК мишени с точечными заменами во всех положениях PAM, а также целевые ДНК, содержащие точечные мутации H275Y вируса гриппа H1N1 и N501Y вируса SARS-CoV-2. Экспериментальные результаты показали более высокую степень специфичности коллатеральной активности белка ScCas12a по сравнению с AsCas12a при точечных заменах во 2-м и 3-м положении относительно референсного PAM - TTTG. Была подтверждена способность эндонуклеазы ScCas12a различать наличие обозначенных точечных мутаций в ДНК мишенях и выявлено превосходство исследуемой системы по специфичности перед хорошо изученным ортологом, что указывает на потенциал к использованию системы CRISPR-ScCas12a в диагностических приложениях.

The aim of this work was the characterization of the collateral activity of the CRISPR-ScCas12a system from the S. cyanobacteriorum and the determination of its degree of specificity through comparison with the widely described AsCas12a protein from the Acidaminococcus sp. The investigation of the systems specificity level was conducted by the method of measuring the intensity of light signals resulting from the nuclease-mediated cleavage of single-stranded fluorescent DNA reporters induced by the collateral activity following the targeted cleavage of DNA targets by CRISPR-ScCas12a complexes. In the study, specific DNA targets with single-nucleotide substitutions at all positions of the PAM were used, as well as target DNAs containing the H275Y mutation of the H1N1 influenza virus and the N501Y mutation of the SARS-CoV-2 virus. The experimental results showed a higher degree of specificity of the collateral activity of the ScCas12a protein compared to AsCas12a for single-nucleotide substitutions at the 2nd and 3rd positions relative to the reference PAM - TTTG. The ability of the ScCas12a endonuclease to distinguish the presence of the specified single-nucleotide mutations in DNA targets was confirmed, and the superiority of the studied system in specificity over the well-characterized ortholog was established, indicating the potential for the use of the CRISPR-ScCas12a system in diagnostic application.