Детальная информация

Цель – сравнительная оценка лактопероксидазы (ЛПО) и пероксидазы хрена (HRP) в качестве меток для ИФА. Методы: очистка ЛПО из молока (кислотное осаждение, ионообменная и гидрофобная хроматография, гель-фильтрация); определение активности с ABTS (спектрофотометрия) и с флуоресцеином/NaBr (флуориметрия); конъюгация периодатным методом и через лизин–Ni–флюорексон. Результаты: получен гомогенный препарат ЛПО со степенью чистоты RZ = 0,9 и выходом 39,7%. Оптимальные условия детекции с ABTS: для HRP – pH 5,8 и 0,2 мМ H₂O₂, для ЛПО – pH 5,8 и 0,4 мМ H₂O₂. С флуорогенным субстратом флуоресцеином ЛПО проявляет активность (оптимум pH зависит от концентрации фермента), тогда как HRP в исследованных условиях не генерирует Eosin Y из флуоресцеина. Конъюгация ЛПО с антителами и по альтернативной схеме не привела к получению функционального конъюгата, способного специфически детектировать антиген в ИФА. Функциональный конъюгат для детекции His-tag белка получен только для HRP. Область применения: разработка иммуноферментных и флуориметрических тест-систем. Выводы: ЛПО активна в отношении хромогенных и флуорогенных субстратов, однако в условиях данной работы не удалось получить эффективного конъюгата ЛПО для использования в ИФА. Флуоресцеин специфичен для ЛПО. Дальнейшие исследования должны быть направлены на оптимизацию условий конъюгации ЛПО.

Aim – comparative evaluation of lactoperoxidase (LPO) and horseradish peroxidase (HRP) as labels for ELISA. Methods: LPO purification from milk (acid precipitation, ion‑exchange and hydrophobic chromatography, gel filtration); activity assay with ABTS (spectrophotometry) and with fluorescein/NaBr (fluorimetry); conjugation using periodate and via lysine–Ni–Fluorexone. Results: A homogeneous LPO preparation was obtained (purity RZ = 0.9, yield 39.7%). Optimal ABTS detection conditions: for HRP – pH 5.8 and 0.2 mM H₂O₂; for LPO – pH 5.8 and 0.4 mM H₂O₂. With the fluorogenic substrate fluorescein, LPO shows activity (pH optimum depends on enzyme concentration), whereas HRP does not generate eosin Y from fluorescein under the conditions tested. Conjugation of LPO with antibodies and via the alternative scheme did not yield a functional conjugate capable of specifically detecting an antigen in ELISA. A functional conjugate for His-tagged protein detection was obtained only for HRP. Application: development of ELISA and fluorimetric test systems. Conclusions: LPO is active towards chromogenic and fluorogenic substrates; however, under the conditions of this work, an effective LPO conjugate for use in ELISA could not be obtained. Fluorescein is specific for LPO. Further research should focus on optimizing LPO conjugation conditions.