Детальная информация

Никотинамид аденин динуклеотид (NAD) - участник важнейших метаболических и сигнальных процессов в клетках человека. NAD является кофактором в окислительно-восстановительных реакциях и выступает в роли субстрата для нескольких семейств регуляторных ферментов. Данные сигнальные процессы принимают участие в регуляции экспрессии генов, прохождения по клеточному циклу, репарации ДНК и апоптоза. Регуляция NAD-зависимых метаболических и сигнальных процессов зависит от способности клетки поддерживать определенный уровень данного динуклеотида. Основным механизмом контроля количества NAD в клетках человека является его биосинтез. В клетках бактерий и простейших эукариот, помимо биосинтеза, описан механизм регуляции уровня NAD путем его расщепления до мононуклеотидов NMN и AMP пирофосфатазами семейства Nudix YjaD и NdxA. Белки NUDT12 и NUDT13 характеризуются наибольшей гомологией к Nudix пирофосфатазам YjaD и NdxA. В данном проекте описываются начальные этапы работы, целью которой является проверка гипотезы о том, что белки NUDT12 и NUDT13 могут регулировать уровень NAD в клетках человека. Нами были созданы векторы для экспрессии His-tag-слитых белков NUDT12 и NUDT13 в бактериальных клетках. Далее была проведена трансформация клеток E. coli (Rosetta) полученными векторами и подобраны условия для эффективной сверхэкспрессии рекомбинантных белков. Уровень экспрессии и размер сверхэкспрессированных белков оценивали при помощи разделения в денатурирующем полиакриламидном геле. Также нами были созданы векторы для экспрессии FLAG-слитых белков NUDT12 и NUDT13 в клетках человека. Белки FLAG-NUDT12 и FLAG-NUDT13 были сверхэкспрессированы в клетках HEK293 после их временной трансфекции соответствующими векторами. После этого мы оценивали уровень экспрессии и размер сверхэкспрессированных белков при помощи метода иммуноблоттинга, с использованием специфических антител к FLAG-пептиду.