В работе проведен анализ изменений клеточной морфологии в ответ на фотодинамическое воздействие in vitro. Эксперименты проводились методами цифровой голографической томографии. Для изучения морфологических изменений в клетках, происходящих в процессе их гибели, использовался специализированный оптический микроскоп 3D Cell Explorer (Nanolive, Швейцария), в котором реализован принцип голографической томографии. Этот бесконтактный метод основан на технике голографической микроскопии, которая позволяет восстанавливать изменения формы волнового фронта при его прохождении через исследуемый образец. Техника томографии реализуется за счет обработки набора голограмм, зарегистрированных при вращении зондирующего пучка. В результате численной обработки полученного набора голограмм производится восстановление трехмерного распределения показателя преломления во внутриклеточных структурах, что впоследствии может быть использовано для оценки их состояния, морфологии и определения механизма клеточной гибели. В работе были получены трехмерные пространственные распределения показателя преломления в клетках и определены основные морфологические параметры клеток: объем, средняя высота, площадь мембраны. Была изучена реакция клеток на фотодинамическое воздействие (ФДВ) при разных дозах, и изменения в морфологии были сопоставлены с основными путями гибели клеток, апоптозом и некрозом. В работе исследовалась реакция клеток карциномы человека HeLa и фибробластов мыши 3T3 на ФДВ методом голографической томографии. ФДВ осуществлялось с использованием фотосенсибилизатора (ФС) Радахлорин. Образцы культивировались в чашках Петри в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы и 1% пенициллина/стрептомицина в атмосфере 5% СО2 при 37 °C. Перед проведением экспериментов клетки выдерживались в растворе, содержащем фотосенсибилизатор в концентрации 5 мкг/мл или 10 мкг/мл в течение 4 часов, при этом происходило его проникновение внутрь клеток. Затем раствор заменялся на чистую культуральную среду. После этого клетки облучались излучением полупроводникового лазера на длине волны 660 нм, соответствующей максимуму полосы поглощения фотосенсибилизатора, что приводило к образованию активных форм кислорода внутри клеток и к их последующей гибели. Клетки подвергались ФДВ на трех различных дозах облучения: 5 Дж, 10 Дж, 20 Дж. Было проанализировано 6 групп клеток, зафиксированных через 24 часа после ФДВ на разных дозах облучения и при разных концентрациях фотосенсибилизатора. В результате статистического анализа были выделены существенные различия в изменении количественных морфологических параметров клеток линии HeLа, которые соответствуют двум основным путям клеточной гибели: апоптозу, который сопровождается округлением клетки, увеличением плотности цитоплазмы и органелл с последующим образованием мелких пузырей (блеббинг), и некрозу, характеризующемуся набуханием цитоплазмы, разрушением органелл, разрывом клеточной мембраны и вытеканием внутриклеточного содержимого наружу. Пути некроза и апоптоза изучались в динамике на клетках HeLa и 3T3 на протяжении 2,5 часов после проведения ФДВ. Данные, полученные с помощью голографической томографии, были подтверждены стандартным тестом на целостность клеточных мембран, проведенным с использованием конфокального флуоресцентного микроскопа. Морфологические параметры тех же фиксированных клеток определялись на основании обработки наборов флуоресцентных изображений, полученных с помощью конфокальной микроскопии с окрашиванием клеток стандартным набором красителей. Показано хорошее соответствие данных полученных двумя различными методами.

The experimental analysis was performed on changes of cellular morphology in response to photodynamic treatment in vitro. Experiments were performed by means of digital holographic tomography. 3D spatial distributions of refractive index in cells were obtained and main morphological parameters of cells were determined: volume, average height, membrane area. The cellular response to treatment at different doses was studied and changes in morphology were correlated with major cell death pathways, apoptosis and necrosis. The necrosis and apoptosis pathways were studied in dynamics. The results obtained by holographic tomography were validated using a standard test for cellular membrane integrity, conducted using a confocal fluorescent microscope. The morphological parameters of the same fixed cells were determined by processing of sets of fluorescent images obtained using confocal microscopy with cell staining. The good agreement of the data obtained by two different methods was demonstrated.