Тема выпускной квалификационной работы: «Роль нуклеазного и хеликазного доменов Cas3 в интерференции и праймированной адаптации в системе CRISPR-Cas I-E».Целью данной работы является определение роли ключевых аминокислотных остатков хеликазного и нуклеазного доменов Cas3, а также роль нуклеазы RecBCD в праймированной адаптации и интерференции в системе CRISPR-Cas I-E Escherichia coli. В исследовании использован штамм E. coli с автотаргетирующей системой CRISPR-Cas, которая содержит CRISPR-кассету с одним спейсером, мишенью которого является протоспейсер в собственном геноме клетки.Показано, что внесение аминокислотных замен в нуклеазный (H74A, H74A и D75A) и хеликазный (D452A, K320N) домены Cas3 снижает эффективность интерференции. С помощью высокопроизводительного секвенирования показано, что все изученные замены оказывают влияние на эффективность праймированной адаптации, но в разной степени. Замена H74A в нуклеазном домене снижает эффективность праймированной адаптации в 50 раз. Остаточный уровень праймированной адаптации в клетках, содержащих Cas3 H74A , обусловлен неполной инактивацией нуклеазной активности Cas3. Аминокислотная замена D452A приводит к тысячекратному снижению эффективности адаптации. Замена K320N в ~ 2 раза снижает эффективность праймированной адаптации в PAM-проксимальной области протоспейсера-мишени и в ~ 200 раз в PAM-дистальной области. Ингибирование праймированной адаптации в PAM-дистальной области в штамме с Cas3 K320N обусловлено хеликазой-нуклеазой RecBCD.

The subject of the graduate qualification work is «The role of the Cas3 nuclease and helicase domains in interference and primed adaptation in the type I-E CRISPR-Cas system».The given work is devoted to elucidating the role of key amino acid residues of the Cas3 helicase and nuclease domains, as well as the role of the RecBCD nuclease in primed adaptation and interference in the type I-E CRISPR-Cas system of Escherichia coli. We used an E. coli strain with the CRISPR-Cas self-targeting system, which contains a CRISPR array with a single spacer targeting a chromosomal protospacer.We demonstrate that amino acid substitutions in the nuclease (H74A, H74A, and D75A) and helicase (D452A, K320N) domains of Cas3 reduce the interference efficiency. Using high-throughput sequencing, we show that all of the studied substitutions affect the primed adaptation efficiency, but to a different degree. The H74A substitution in the nuclease domain reduces the primed adaptation efficiency by 50 times. The residual level of primed adaptation in cells containing Cas3 H74A is due to incomplete inactivation of the Cas3 nuclease activity. The D452A substitution leads to a thousandfold decrease in the adaptation efficiency. The K320N substitution reduces the primed adaptation efficiency by ~2 times in the PAM-proximal region of the priming protospacer and by ~200 times in the PAM-distal region. The inhibition of primed adaptation in the PAM-distal region in the strain with Cas3 K320N is due to the RecBCD helicase-nuclease.