Details

В рамках работы были сконструированы плазмиды, кодирующие модифицированный ген NS вируса гриппа со вставками протективных антигенов M. tuberculosis. Гены были искусственно синтезированы и клонированы в вектор pHW2006. Полученные плазмиды были трансформированы в бактериальный штамм E.coli DH5α, накоплены и очищены. Методом обратной генетики была проведена сборка нескольких вариантов рекомбинантных вирусов гриппа, различающихся вставками протективных антигенов M. tuberculosis в гене NS. Был проведен отбор штаммов с высокими ростовыми характеристиками путем клонирования вирусов в куриных эмбрионах. С помощью ПЦР со специально подобранных пар праймеров были определены длины гетерологичных вставок в полученных вирусах, которые оказались короче теоретически предсказаных. Методом секвенирования определены нуклеотидные последовательности полученных вариантов. Из полученных клонов был выбран наиболее генетически стабильный штамм с максимально сохранившейся вставкой протективных антигенов M. tuberculosis без сдвига рамки считывания. Методами Вестерн-блот и иммунофлуоресценции была показана экспрессия белка ESAT-6 в выбранном штамме. Показано, что штамм является холодоадаптированным и температурочувствительным. Проведено исследование безопасности и иммуногенности штамма на мышах BALB/c и C57/black. Показано, что штамм является аттенуированным для мышей и стимулирует специфический Т-клеточный ответ к антигенам M. tuberculosis.