Данная работа посвящена изучению регуляции и причин преодоления бактериофагом системы рестрикции-модификации Esp1396I. Для изучения механизма регуляции системы рестрикции-модификации Esp1396I была использована плазмидная система, содержащая гены флуоресцентных белков Venus и mCherry под промоторами метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции соответственно, а также С-белок под индуцируемым промотором. Такая система позволяет изменять концентрацию С-белка в клетках путем добавления различных концентраций индуктора в питательную среду бактерий. В результате этого возможно наблюдать за изменением динамики синтеза флуоресцентных белков в зависимости от концентрации С-белка в клетках. Для детекции флуоресценции использовали методы флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии. Для изучения защитных свойств системы Esp1396I, она была помещена в плазмидный вектор pBR322, к генам метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции были добавлены гены флуоресцентных белков. Для изучения причин преодоления защитных свойств системы бактериофагом к клеткам, содержащим флуоресцентно-меченую систему рестрикции-модификации Esp1396I, добавляли бактериофаг λ и наблюдали за ходом вирусной инфекции в одиночных бактериях с помощью флуоресцентной микроскопии. В результате проведенных экспериментов было обнаружено общее согласие с теоретическими представлениями о регуляции системы Esp1396I. Предполагается, что защитные свойства Esp1396I, во многом должны зависеть не только от абсолютных количеств белков системы рестрикции-модификации в клетке, но и от их соотношения. Изучение методом флуоресцентной микроскопии соотношения метилтранфсеразы и эндонуклеазы рестрикции в клетках с флуоресцентно-меченой системой Esp1396I, подвергшихся вирусной инфекции, подтвердило, что отношения белков в клетках, погибших в результате вирусной инфекции, и отношения белков в неифицированных клетках, статистически отличаются.

This work is devoted to the investigation of Esp1396I restriction-modification system mechanism of regulation and reasons of its protection overcoming by bacteriophage λ. To study the regulation mechanism of Esp1396I restriction-modification the set of plasmids containing Venus and mCherry fluorescent protein genes under methyltransferase and restriction endonuclease promoters respectively and C-protein gene under inducible promoter were used. Such a system allows to vary C-protein concentration in cells by adding different inducer concentrations to bacteria nutrient medium. As a result, it is possible to observe changes in the fluorescent protein synthesis dynamics which depend on C-protein concentration in the cells. To detect fluorescence we used methods of fluorescent microscopy and fluorescence spectroscopy. To study Esp1396I system protective properties, this restriction-modification system was inserted into pBR322 plasmid vector and methyltransferase and restriction endonuclease genes were fused with Venus and mCherry fluorescent protein genes respectively. To study the reasons of restriction-modification system protection overcoming by bacteriophage viral infection in single cells carrying fluorescently-labeled Esp1396I system was observed by fluorescence microscopy. As a result, general agreement was found with the theoretical view on the Esp1396I restriction-modification system regulation. It was assumed that Esp1396I protective properties should not only depend on absolute restriction-modification system proteins amount, but also their ratio. Study of methyltransferase to restriction endonuclease ratio in single cells by fluorescence microscopy method was implemented in cell containing fluorescently-labeled system Esp1396I. We found that the ratio of restriction-modification proteins in infected and non-infected cells are statistically different.