Details

Тема выпускной квалификационной работы: «Применение количественной MALDIмасс-спектрометрии для определения концентрации альфа-2-макроглобулина и фибринопептида А в сыворотке крови человека». Данная работа посвящена разработке метода количественной оценки концентраций таких маркеров воспаления, как альфа-2-макроглобулин и фибринопептид А в цельной сыворотке крови с помощью MALDI-TOFмасс-спектрометрии с применением изотопно-меченных внутренних стандартов. В результате работы были идентифицированы пептиды, входящие в состав рассматриваемых маркеров, и получены изотопно-меченые стандарты из синтезированных аналогов. Было определено оптимальное время детекции исследуемых соединений, а также установлены особенности протекания ферментативной реакции трипсина с альфа-2-макроглобулином и со вторым по значимости ингибитором протеаз –альфа-1-антитрипсином в сыворотке крови человека. Таким образом, разработан и верифицирован метод количественной оценки сывороточных уровней альфа-2-макроглобулина и фибринопептида А с применением современных масс-спектрометрических подходов, позволяющий проводить анализ в сыворотке крови без её предварительного фракционирования. Также продемонстрирована возможность совместного измерения двух биомаркеров в ходе одного эксперимента. Предложенный в работе метод обладает рядом преимуществ, так как является более простым в реализации по сравнению со стандартными методами количественного анализа сывороточных маркеров, а также более быстрым, так как общее время анализа в настоящий момент составляет порядка 1 часа от момента получения образца сыворотки крови пациента до количественной оценки уровней изучаемых соединений.

The topic of the graduation work: “Application of quantitative MALDI mass spectrometry to determine the concentration of alpha-2-macroglobulin and fibrinopeptide A in human serum". This work is devoted to the development of a method for the quantitative assessment of the concentrations of such inflammatory markers as alpha-2-macroglobulin and fibrinopeptide A in blood serum using MALDI-TOF mass spectrometry with an isotopically labeled internal standards. As a result of the work, the peptides included in the considered markers were identified, and isotopically labeled standards were obtained from the synthesized analogs. The optimal detection time for the considered compounds was determined, and the features of the enzymatic reaction of trypsin with alpha-2-macroglobulin and alpha-1-antitrypsin -the second most important protease inhibitor in human serum -were established. In conclusion, the method for quantitative assessment of serum levels of alpha-2-macroglobulin and fibrinopeptide A using modern mass spectrometric approaches has been developed and verified. It allows analysis in blood serum withoutitspreliminary fractionation. The proposed methodis simpler to implement in comparison with standard methods of quantitative analysis of serum markers, and also faster, since the total analysis time is about 1 hour from the moment of obtaining a sample of the patient's blood serum to quantifying the levels of the considered compounds.

• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • 1.1. Определение понятия и общая характеристика компонентов воспаления
  • 1.2. Осложнения вирусных и бактериальных инфекций
  • 1.3. Современные методы диагностики сепсиса
  • 1.4. Сывороточные маркеры воспалительного процесса
    • 1.4.1. Фибринопептид А как биомаркер воспаления, сепсиса и других патологических состояний
    • 1.4.2. Альфа-2-макроглобулин как биомаркер воспаления, сепсиса и других патологических состояний
  • 1.5. Масс-спектрометрия - современный метод диагностики
    • 1.5.1. Метод масс-спектрометрии
    • 1.5.2. Масс-спектрометрия белков
    • 1.5.3. Метод MALDI с использованием времяпролётного анализатора (MALDI-TOF)
    • 1.5.4. Проблемы количественного масс-спектрометрического анализа
    • 1.5.5. Методика количественного анализа целевых белков методом MALDI-TOF
  • 1.6 Заключение
• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  • 2.1. Банк сывороток
  • 2.2. Получение референсного сывороточного альфа-2-макроглобулина
  • 2.3. Регистрация и обработка масс-спектров
  • 2.4. Обработка трипсином сывороток крови человека
  • 2.5. Измерение фибринопептида А в сыворотке крови человека
  • 2.6. Применение изотопно-меченых пептидов для количественной оценки сывороточных маркеров воспаления
  • 2.7. Иммуноферментный анализ
• ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
  • 3.1. Поиск и идентификация сывороточных пептидов, относящихся к альфа-2-макроглобулину и фибринопептиду А
  • 3.2. Применение изотопно-меченых стандартов синтетических пептидов для измерения концентрации изучаемых биомаркеров
  • 3.3. Изучение стабильности детектируемого фрагмента фибринопептида А
  • 3.4. Изучение отличий сывороточных форм фибринопептида А
  • 3.5. Количественные результаты для фибринопептида А
  • 3.6. Получение кинетических кривых накопления продуктов триптического гидролиза альфа-2-макроглобулина
  • 3.7. Изучение особенностей протекания реакций трипсина с основными ингибиторами протеаз в сыворотке крови
  • 3.8 Верификация масс-спектрометрического подхода для количественного измерения альфа-2-макроглобулина в сыворотке крови с помощью коммерческого набора для иммуноферментного анализа
  • 3.9. Возможные причины расхождения значений концентрации α2-МГ, полученных разными методами
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• ВЫВОДЫ
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ