Details

Данная работа посвящена разработке протокола выделения функционально активных неструктурных белков 3CL-Pro (Nsp5) и RdRp (Nsp12) из SARS-CoV-2, а также исследованию их взаимодействия с потенциальными ингибиторами, подобранными из числа зарегистрированных терапевтических препаратов. Для очистки белков использовались такие методы, как металлоаффинная хроматография, ионообменная хроматография, обратная хроматография на гепарине, гель-фильтрация. Была подтверждена протеолитическая активность выделенного 3CL-Pro и проведен invitro анализ взаимодействия белка с потенциальными ингибиторами. Для связывания RdRp с факторами процессивности Nsp7 и Nsp8 был приготовлен двуцепочечный РНК‑субстрат.  Была проверена ферментативная активность белка в комплексе с кофакторами и субстратом. Результаты проделанной работы могут служить основой для дальнейших исследований по разработке методик лечения и препаратов, позволяющих прервать жизненный цикл коронавируса еще до начала этапа сборки новых вирусных частиц в клетке.

The given work is devoted to the development of a functionally active non-structural SARS-CoV-2 3CL-Pro (Nsp5) and RdRp (Nsp12) proteins purification protocol, and to the study of their interaction with potential inhibitors selected from registered therapeutic drugs. For protein purification were used such methods as metal-affinity chromatography, ion-exchange chromatography, reverse heparin chromatography, and gel-filtration. After confirmation of the proteolytic activity of 3CL-Pro, an in vitro analysis of the interaction of the protein with potential inhibitors was carried out. To bind RdRp to Nsp7 and Nsp8 co-factors a double-stranded RNA substrate was prepared. The enzymatic activity of the protein in combination with cofactors and substrate was tested. The results of this work can be used for further research on the development of treatment methods and drugs that can interrupt the life cycle of coronavirus even before the assembly of new viral particles in the cell begins.