Задачи исследования: - Разработать состав лизирующего буфера, позволяющего эффективно экстрагировать генетический материал из образца; - Разработать протокол термической экстракции генетического материала из образца; - Оценить эффективность различных способов экстракции генетического материала и выбрать оптимальный. Объектом исследования данной работы являются различные методы экстракции генетического материала из образца. Предметом исследования является изучение наиболее простого и хорошо подходящего для использования в реакции изотермической амплификации способа экстракции генетического материала из образца. При написании литературного обзора использовались следующие базы данных: eLIBRARY.RU, PubMed. Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием пакета программ Microsoft Excel. Работа была выполнена на базе лаборатории НИК «Нанобиотехнологии» Санкт Петербургского государственного политехнического университета Петра Великого. В ходе исследования стало ясно, что наиболее эффективным методом экстракции генетического материала из образца является метод с водой Milli-Q. Все протестированные составы буферов показали результаты хуже, чем метод термической экстракции водой Milli-Q. Был составлен протокол экстракции.

The tasks of the study: - To develop the composition of a lysing buffer that allows efficient extraction of genetic material from a sample; - To develop a protocol for thermal extraction of genetic material from a sample; - Evaluate the effectiveness of various methods of extracting genetic material and choose the best one. The object of the study of this work is various methods of extraction of genetic material from a sample. The subject of the study is the study of the simplest and most suitable method for extraction of genetic material from a sample for use in an isothermal amplification reaction. When writing the literary review, the following databases were used: eLibrary.RU, PubMed. Statistical processing of experimental data was carried out using the Microsoft Excel software package. The work was carried out in the analytical center of nano- and biotechnologies of Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University. During the study, it became clear that the most effective method of extracting genetic material from a sample is the Milli-Q water extraction method. All tested buffer formulations showed worse results than the Milli-Q water extraction method. An extraction protocol was drawn up.

• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
• 1.1. Бактериальные и вирусные патогены
• 1.2. Методы диагностики бактериальных и вирусных заболеваний
• 1.3. Системы CRISPR-Cas
  • 1.3.1. Открытие систем CRISPR-Cas
• 1.3.2. Классификация систем CRISPR-Cas
• 1.3.3. Механизм систем CRISPR-Cas
• Рисунок 1.1. - Механизм работы системы CRISPR-Cas
• 1.3.4. Коллатеральная активность систем CRISPR-Cas
• 1.3.5. Применение систем CRISPR-Cas в современной биотехнологии
• 1.3.5.1. Геномное редактирование
• 1.3.5.2. Диагностика с помощью систем CRISPR-Cas
• 1.3.5.3. Диагностика с помощью метода SHERLOCK
• 1.3.5.4. Регуляция экспрессии генов
• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
• 2.1. Выбор оптимального способа лизиса образца
• 2.2. Тестирование лизирующего буфера №1
• 2.2.1. Подготовка состава лизирующего буфера №1
• 2.2.2. Обратная транскрипция в буфере №1
• 2.2.3. Амплификация буфера №1
• 2.3. Тестирование составов лизирующего буфера №2 и №3
• 2.3.1. Подготовка составов лизирующего буфера №2 и №3
• 2.3.2. Обратная транскрипция в буферах №2 и №3
• 2.3.3. Амплификация в буферах №2 и №3
• 2.3.4. Реакция RPA
• 2.4. Тестирование состава лизирующего буфера №4
• 2.4.1. Подготовка состава лизирующего буфера №4
• 2.4.2. Обратная транскрипция в буфере №4
• 2.4.3. Амплификация буфера №4
• 2.4.4. Реакция RPA в буфере № 4
• ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
• 3.1. Результаты сравнения способов лизиса образца и выбор оптимального
• 3.2. Результаты амплификации в буфере №1
• 3.3. Результаты амплификации в буферах №2 и №3
• 3.4. Результаты реакции RPA в буферах №2 и №3
• 3.5. Результаты амплификация генетического материала после его экстракции в буфере №4
• 3.6. Результаты реакции RPA с пробой, прошедшей лизис в буфере №4
• 3.7. Результаты метода экстракции генетического материала с помощью воды Milli-Q
• ГЛАВА 4. ОБЕСПЕЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ УСЛОВИЙ ТРУДА
• 4.1. Анализ опасных и вредных факторов при проведении научных исследований в лаборатории
• 4.2. Мероприятия по пожароопасности
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
• 1. Иконникова, Н. В. Бактериофаги ( вирусы бактерий: Учебное пособие / Н.В. Иконникова (сост.). – Минск: ИВЦ Минфина, 2017. – 41 с.
• 2. Общие сведения о вирусных инфекциях [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.msdmanuals.com/ru/home (Дата обращения 16.03.2024)
• 3. Отслеживание вариантов вируса SARS-CoV-2 [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.who.int/ru/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants (Дата обращения 16.03.2024)
• 4. Пиневич А.В., Сироткин А.К., Гаврилова О.В., Потехин А.А. Вирусология — Учебники и учебные пособия для высших учебных заведений. – Издательство Санкт-Петербургского государственного университета, 2020 – 440 с.
• 5. Страчунского Л. С., Белоусова Ю. Б., Козлова С. Н. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии /Под ред. Л. С. Страчунского, Ю. Б. Белоусова, С. Н. Козлова. Смоленск: МАКМАХ, 2007. - 464 с.
• 6. Тец В.В. Микроорганизмы и антибиотики. Инфекции кожи, мягких тканей, костей и суставов. — СПб.: КЛЕ Т, 2006. — 128 с.
• 7. Andersson M., Turesson H., Nicolia A., et al. Efficient targeted multiallelic mutagenesis in tetraploid potato (So- lanum tuberosum) by transient CRISPR-Cas9 expression in protoplasts. Plant Cell Rep. 2017, 36(1), 117‒128. doi: 10.1007/s00299-016-2...
• 8. Barrangou R. CRISPR-Cas systems and RNA-guided interference. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2013;4(3):267–78.
• 9. Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science 2018; 360: 436-439.
• 10. Cong L., Ran F. A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P. D., Wu X., Jiang W., Marraffini L. A., Zhang F. 2013. Mul- tiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339: 819—823.
• 11. Deveau H., Barrangou R., Garneau J. E., Labonté J., Frema- ux C., Boyaval P., Romero D. A., Horvath P., Moineau S. 2008. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol. 190 : 1390—1400.
• 12. Ding Q., Regan S. N., Xia Y., Oostrom L. A., Cowan C. A., Musunuru K. 2013. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 : 393—394.
• 13. E. Abadia, J. Zhang, T Vultos, K. Kremer, E. Aktas, T. Matsumoto, G. Refregier, Dv Soolingen B. Gicquel, C. Sola Fine MJ, Smith MA, Carson CA, et al. Prognosis and outcomes of patients with community-acquired pneumonia, JAMA, 1996, vol. 275 (pg....
• 14. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and CSM6. Science 2018;360:439-444.
• 15. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ, Joung J, Verdine V, Donghia N, Daringer NM, Freije CA, Myhrvold C, Bhattacharyya RP, Livny J, Regev A, Koonin EV, Hung DT, Sabeti PC, Collins JJ, Zhang F. Nucleic acid detection with CR...
• 16. Hille F, Richter H, Wong SP, Bratovič M, Ressel S, Charpentier E. The biology of CRISPR-Cas: backward and forward. Cell. 2018;172(6):1239–59.
• 17. Hummel A.W., Chauhan R.D., Cermak T., et al. Allele ex- change at the EPSPS locus confers glyphosate tolerance in cassava. Plant Biotechnol. J., 2018, 16, 1275–1282. doi: 10.1111/pbi.12868
• 18. Jinek M, Chilynksi K, Fonfara I, Hauer M, Doudna J, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012;337: 816–821.
• 19. Miller SE. Electron microscopy of viral infections. In: Lennette EH, Smith TF, editors. Laboratory diagnosis of viral infections. 3rd ed. New York, NY: Marcel Dekker, Inc.; 1999. p. 45–70.
• 20. Myhrvold C, Freije CA, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Metsky HC, Durbin AF, Kellner MJ, Tan AL, Paul LM, Parham LA, Garcia KF, Barnes KG, Chak B, Mondini A, Nogueira ML, Isern S, Michael SF, Lorenzana I, Yozwiak NL, MacInnis BL, Bosch I, Gehrke L, Z...
• 21. Pickar-Oliver A, Gersbach CA. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(8):490–507.
• 23. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S. & Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636–646 (2010).
• 24. Zaayman D, Human S, Venter M. A highly sensitive method for the detection and genotyping of West Nile virus by real-time PCR. J Virol Methods. 2009;157:155–60.