Details

Данная работа посвящена исследованию роли редуктивного стресса в регуляции пролиферации эмбриональных стволовых клеток. Целью работы было исследовать влияние экзогенных лентивирусных конструкций, содержащих LbNOX и mitoLbNOX, на пролиферацию ЭСК, нокаутных по гену Ndufs1. Для достижения поставленной цели было проведено переклонирование кДНК LbNOX и mitoLbNOX в лентивирусный вектор, проверка влияния временной экспрессии этих генов на пролиферацию ЭСК мыши, нокаутных по Ndufs1, сборка вирусных частиц с кДНК GFP и наших генов, расчёт ихтитра. Использованные методы: трансформация клеток E.coli, трансфекция и трансдукция эукариотических клеток, сборка, паковка и подсчёт титра лентивирусов, иммуноцитохимическое окрашивание, проточная цитометрия, дисперсионный анализ , T-критерий Стьюдента. В ходе работы были получены лентивирусноые вектора с кДНК LbNOX и mitoLbNOX, было исследовано влияние временной экспрессии данных генов в контрольных и Ndufs1-/- ЭСК мыши, был измерен титр GFP содержащего вируса. Результаты данной работы могут быть использованы для дальнейших исследований в области метаболизма ЭСК, которые улучшают понимание механизмов функционирования стволовых клеток, что важно для развития клеточных технологий и практического применения стволовых клеток.

The given work is devoted to investigation of the role of reductive stress in the regulation of embryonic stem cell proliferation The goal of this work was to investigate the influence of exogenous lentivirus constructs that contain water-forming NADH oxidases LbNOX and mitoLbNOX on proliferative activity of mouse stem cells with Ndufs1-/-. To achieve the goal cloning LbNOX and mitoLbNOX cDNAs into lentivirus vector, check of temporary expression of LbNOX and mitoLbNOX in NDUFS1 gene knockout embryonic stem cells influence, lentivirus particle containing control GFP cDNA, LbNOX and mitoLbNOX cDNAs assembly and titer measurement were carried out. Methods that were used in this work: E.coli cells transformation , eukaryotic cell transfection and transduction, lentivirus particle assembly, titer measurement on HEK 293T cells and mESC, eukaryotic cell immunocytochemistry, flow cytometry, statistical analysis (ANOVA, Students t-test ). As a result of this work lentivirus based genetic constructs that contain LbNOX and mitoLbNOX cDNA were acquired, investigation of temporary expression of these genes in control and Ndufs1-/- mouse embryonic stem cells influence was performed, titer of control GFP containing virus was measured. Results of this work can be used as a base for further investigation in embryonic stem cell metabolism field. Research in this sphere improve our understanding of the stem cells functioning mechanisms which is important for introduction of this technology into the practice of regenerative medicine.