Details

Данная работа посвящена изучению роли протеасомного регулятора PA28αβ в ранней дифференцировке эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши. Первый этап работы заключался в верификации нокаута, полученного ранее в лаборатории путем редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9. Для этого из клеточных линий, не экспрессирующих продукт гена Psme1, белок PA28α, была выделена геномная ДНК, амплифицированы участки гена Psme1 в области протоспейсера, последовательность которых была проверена секвенированием по Сэнгеру. Так же было проверено отсутствие изменений в последовательностях, являющимися наиболее вероятными местами побочного редактирования (off-target). Второй этап работы включал серию экспериментов с использованием полученных клеточных линий ЭСК мыши с нокаутом гена Psme1, в которых был проанализирован плюрипотентный статус клеток с помощью тератомного теста; проведена направленная дифференцировка in vitro; осуществлен анализ клеточной пролиферации и уровней активных форм кислорода (АФК) методом проточной цитометрии; оценена экспрессия специфических генов при помощи количественной ПЦР. Исходя из полученных результатов было сделано заключение, что ЭСК мыши с нокаутом гена Psme1 сохраняют статус плюрипотентности и способность дифференцироваться во все три зародышевых направления in vivo. Однако нокаут гена α-субъединицы регулятора PA28αβ приводит к снижению темпов пролиферации и повышению уровней АФК в ЭСК мыши. Эти данные говорят о важной роли исследуемого регулятора в дифференцировке стволовых клеток. Полученные в работе данные позволят в дальнейшем расширить понимание фундаментальных механизмов дифференцировки ЭСК, что может быть критически важно в развитии регенеративной медицины и в биомедицинских исследованиях на моделях различных болезней человека на основе плюрипотентных стволовых клеток.

The GQW is devoted to the study of the effect of the proteasome activator PA28αβ on the early differentiation of mouse embryonic stem cells (ESCs). The first stage of the GQW was to validate the CRISPR/Cas9-mediated Psme1 knockout cell lines previously obtained in the laboratory. For this purpose, genomic DNA was extracted from treated cells and the region of Psme1 gene surrounding the gRNA target site was amplified by PCR and Sanger-sequenced. Regions where the gRNA off-target event was predicted, was also checked for any insertion or deletion (indels). The second stage of the GQW was to study the function of PA28 αβ in ESCs differentiation using various approaches, including teratoma assay; cell differentiation in vitro; propidium iodide (PI) cell viability flow cytometry; flow cytometry of intracellular reactive oxygen species (ROS) with DCF staining; quantitative PCR (qPCR). Based on the results obtained in the GQW, we conclude that Psme1 knockout does not affect self-renewal and pluripotency in mouse ESCs. However, PA28αβ-deficient ESC exhibits a decreased proliferation rate and is characterized by increased ROS level.  These data suggest an important role for PA28αβ regulator in ESC differentiation and may be useful for understanding of the fundamental mechanisms of ESC differentiation and the further development of regenerative medicine and for research of various diseases based on model stem cells.