В данной работе разработана ДНК-конструкция для характеризации стабильности нуклеосом на уровне одиночных молекул. Подготовка ДНК-конструкции включала вставку позиционирующей нуклеосому последовательности 603 в плазмидный вектор размером 11,3 тысячи п.о. с помощью клонирования по методу Гибсона (Gibson Assembly), а также трансформацию и выделение фрагмента из клеточной культуры после выращивания достаточного количества биомассы. Конечная ДНК-конструкция была использована для реконструкции нуклеосом методом градиентного солевого диализа с постоянно убывающей концентрацией соли. Реконструкция нуклеосом была подтверждена измерением силы разворачивания внутреннего витка отдельных нуклеосом с помощью оптического пинцета с двойной ловушкой. Полученные результаты могут быть использованы для изучения взаимодействия нуклеосом с регуляторными белками на уровне одиночных молекул.

In this thesis we describe the DNA preparation protocol for characterization of nucleosome stability at the single-molecule level. The preparation of the DNA construct involved the insertion of the ‘603’ nucleosome positioning sequence into 11.3 kbp plasmid vector using Gibson Assembly cloning, transformation and extraction of the fragment from cell culture after growing sufficient amount of biomass. The final DNA construct was used to reconstitute nucleosomes by gradient salt dialysis with descending salt concentration. The reconstitution of nucleosomes was confirmed by measuring force-extension behavior of individual nucleosomes using dual trap optical tweezers. The obtained results could be further used to study the interaction of nucleosomes with regulatory proteins at single-molecule level.

• Введение
• Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • 1.1 Особенности строения нуклеосом
  • 1.2 Функции нуклеосом
  • 1.3 Последовательности позиционирования нуклеосом.
  • 1.4 Лазерный пинцет.
• Глава 2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
  • 2.1 Рестрикция плазмидного вектора
  • 2.2 Сборка с помощью метода Гибсона
  • 2.3 Трансформация плазмиды.
  • 2.4 Выделение ДНК
  • 2.5 Намотка нуклеосом
  • 2.6 Проверка намотки с помощью оптического пинцета
• Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
• СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ: