Details

Данная работа посвящена исследованию флуоресценции FAD в свободной и связанной с ферментом липоамид дегидрогеназа (LipDH), при одно- и двухфотонном возбуждении фемтосекундными лазерными импульсами в диапазоне длин волн 360–450 нм и 720–890 нм. Целью этой работы является установление особенностей процессов релаксации свободного FAD и связанного с ферментом LipDH. Исследования проводились методом время-разрешенной поляризационной лазерной спектроскопии, в рамках которого регистрировались сигналы затухания двух ортогональных поляризованных компонент с время-корреляционной системы счета фотонов. Было обнаружено, что FAD, связанный с ферментом LipDH характеризуется двумя временами затухания флуоресценции: τ1 = 0.27 нс (a1 = 0.17) и τ2 = 4.34 нс (a2 = 0.83), где в скобках указаны весовые коэффициенты. При этом свободный FAD характеризуется четырьмя временами затухания флуоресценции: τ1 = 20 пс (a1 = 0.38), τ2 ∼ 220 пс (a2 = 0.13), τ3 = 2.3–2.6 нс (a3= 0.34) и τ4 = 3.7–4.8 нс (a4 = 0.15), где в скобках указаны весовые коэффициенты. Было установлено, что времена τ1 и τ2 обусловлены процессами релаксации двух различных сложенных конформаций FAD, а время τ4 обусловлено флуоресценцией развернутой конформации FAD. Две сложенные конформации различаются положением аденина над изоаллоксазиновым кольцом. Экспериментально полученное изменение весовых коэффициентов FAD в водно-спиртовых растворах подтверждает модель распределения конформаций, посчитанную методом молекулярной динамики. Также были проведены исследования анизотропии флуоресценции свободного FAD от длины волны возбуждения при одно- и двухфотонном возбуждении. Для FAD, связанного с LipDH, зарегистрировано субнаносекундное время затухания анизотропии флуоресценции τrb = 130 пс. Оно обусловлено анизотропной колебательной релаксацией в возбужденном состоянии коферментов, которая сопровождалась оворотом дипольного момента перехода за счет перестройки конфигурации ядер в молекуле FAD. Полученные результаты имеют большую научную значимость, так как они могут быть использованы для описания результатов исследований окислительно-восстановительных реакции в клетках живых организмов флуоресцентными методами, а также для разработки неинвазивных методов диагностики социально-значимых заболеваний на ранних стадиях.

This work focuses on the study of flavin adenine dinucleotide (FAD) fluorescence in free and protein-bound lipoamide dehydrogenase (LipDH), under single- and two-photon excitation using femtosecond laser pulses in the wavelength range 360–450 nm and 720–890 nm, respectively. The aim of the research is to investigate the characteristics of relaxation processes associated with LipDH and free FAD, using the method of high-resolution polarization laser spectroscopy. Two orthogonal fluorescence components are recorded using a photon-counting system with time-correlated measurements. It was found that LipDH-bound FAD exhibits two characteristic fluorescence decay times, τ1 = 0.27 ns (a1 = 0.17) and τ2 = 4.34 ns (a2 = 0.83). Free FAD, on the other hand, exhibits four decay times: τ1 = 20 ps (a1 =0.38), τ2 ∼ 220 ps (a2 = 0.13), τ3 = 2.3–2.6 ns (a3 = 0.34) and τ4 = 3.7– 4.8 ns (a4 = 0.15). It has been determined that the times τ1 and τ2 are associated with the relaxation processes of two distinct folded FAD conformations, while the time τ4 is related to the fluorescence from the unfolded FAD structure. The two folded conformations differ in terms of the position of the adenine relative to the isoalloxazine ring. The experimentally determined change in the FAD weighting coefficients in aqueous alcoholic solutions confirms the conformational distribution model predicted by the molecular dynamics simulation. Additionally, the anisotropy of fluorescence from free FAD excited at different wavelengths has been studied using single- and two-photon excitation. For FAD bound to LipDH, a fluorescence anisotropy decay time of τrb = 130 ps. These results are of significant scientific importance, as they can be utilized to describe the outcomes of redox reaction studies in living cells using fluorescent techniques, as well as for the development of non-invasive techniques for early diagnosis of socially significant diseases.