Details

Данная работа посвящена созданию и экспериментальной оценке рекомбинантной плазмидной конструкции pAAV/CAG:GNAT-IRES-Rhod-mVenus, предназначенной для одновременной экспрессии гена трансдуцина (GNAT) совместно с родопсином (Rhod) в нейрональных клетках сетчатки. Целью данной работы являлась сборка плазмидной конструкции, проверка ее корректности рестрикционным анализом, сборка AAV-вектора на основании полученной конструкции и экспрессия в клеточной культуре HEK293T с использованием AAV-вектора.  Экспериментальная часть включала молекулярное клонирование, трансформацию бактерий E. coli, отбор позитивных клонов, получение и очистку плазмид, а также валидацию конструкции методом рестрикционного анализа и секвенированием. Также была произведена продукция и очистка вирусных частиц AAV, определениt их титра с помощью qPCR и трансдукция ими клеток HEK293T для визуализации экспрессии белка. В результате была получена и подтверждена целевая конструкция, а ее функциональность подтверждена по характерной примембранной экспрессии. Полученные результаты могут быть использованы в оптогенетическом протезировании сетчатки. Выводы подтверждают успешное клонирование конструкции и возможность ее для дальнейших исследований на экспериментальных животных.

This work is devoted to the creation and experimental evaluation of recombinant plasmid construct pAAV/CAG:GNAT-IRES-Rhod-mVenus designed for simultaneous expression of transducin gene (GNAT) together with rhodopsin (Rhod) in retinal neuronal cells. The aim of this work was to assemble the plasmid construct and verify its correctness by restriction analysis, assembly of AAV-vector based on the obtained construct and expression in HEK293T cell culture using AAV-vector.  The experimental part included molecular cloning, transformation of E. coli bacteria, selection of positive clones, obtaining and purifying plasmids, and validation of the construct by restriction analysis and sequencing. We also produced and purified AAV viral particles, determined their titer by qPCR, and transduced HEK293T cells with them to visualize protein expression. As a result, a target construct was obtained and validated, and its functionality was confirmed by the characteristic membrane-associated expression. The results obtained can be used in the field of gene therapy for retinal degenerative diseases based on optogenetic prosthetics. The findings confirm the successful cloning of the construct and its feasibility for further studies on experimental animals.