Details

Данная работа посвящена изучению роли митохондриальной пирофосфатазы NUDT13 в регуляции уровня никотинамидадениндинуклеотида (NAD) в клетках человека. Эффективность NAD-зависимых метаболических процессов зависит от концентрации NAD в каждом конкретном клеточном компартменте, поэтому регуляция уровня данного динуклеотида в клетке крайне важна. Основным способом поддержания уровня NAD является его биосинтез из различных форм витамина B3. Однако в клетках прокариот и простейших эукариот был описан механизм регуляции уровня NAD путем его расщепления пирофосфатазами семейства NUDIX. Белок человека NUDT13 наиболее гомологичен дрожжевой и бактериальной NAD-пирофосфатазам. NUDT13 локализуется в митохондриях и расщепляет NAD(H) in vitro. В данной работе мы проверяем гипотезу о том, что NUDT13 расщепляет NAD в клетках человека HEK293 и регулирует его уровень. С помощью ферментативного метода измерения NAD установлено, что сверхэкспрессия митохондриальной пирофосфатазы NUDT13 приводит к значительному снижению концентрации NAD в экстрактах клеток линии HEK293. С помощью метода проточной цитометрии установлено, что стабильная сверхэкспрессия NUDT13 не влияет на скорость пролиферации клеток. С помощью проточной цитометрии и МТТ-теста установлено, что клетки со стабильной сверхэкспрессией NUDT13 более чувствительны к ингибированию синтеза NAD.

This work is devoted to the study of the role of the mitochondrial pyrophosphatase NUDT13 in the regulation of NAD levels in human cells. The efficiency of NAD-dependent metabolic processes depends on the concentration of NAD in each specific cellular compartment, therefore regulation of this dinucleotide’s level in the cell is extremely important. The main way to maintain NAD levels is its biosynthesis from various forms of vitamin B3. However, in prokaryotic cells and simple eukaryotes, a mechanism of NAD level regulation by its cleavage via pyrophosphatases from the NUDIX family has been described. The human protein NUDT13 is most homologous to yeast and bacterial NAD pyrophosphatases. NUDT13 is localized in mitochondria and cleaves NAD(H) in vitro. In this work, we test the hypothesis that NUDT13 cleaves NAD in human cells and regulates its level. Using an enzymatic method for NAD measurement, it was found that overexpression of mitochondrial pyrophosphatase NUDT13 leads to a significant decrease in NAD concentration in extracts of HEK293 cell line. Using flow cytometry, it was established that stable overexpression of NUDT13 does not affect the proliferation rate of cells. Using flow cytometry and the MTT assay, it was shown that cells with stable NUDT13 overexpression are more sensitive to inhibition of NAD synthesis.

• СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
  • 1.1. Структура и свойства NAD
  • 1.2. Роль NAD в клетке
  • 1.3. Биосинтез NAD
  • 1.4. Компартментализация NAD
  • 1.5. Митохондриальный пул NAD
  • 1.6. Белки суперсемейства NUDIX и их роль
  • 1.7. Белок NUDT13
• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  • 2.1. Культуры клеток
  • 2.2. Ферментативный метод измерения внутриклеточного NAD
  • 2.3. МТТ-тест
  • 2.4. Проточная цитометрия
• ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
  • 3.1. Сравнение концентрации NAD в контрольных клетках и клетках стабильно сверхэкспрессирующих NUDT13
  • 3.2. Сравнение пролиферативной активности контрольных клеток и клеток со стабильной сверхэкспрессией NUDT13
  • 3.3. Изучение влияния стабильной сверхэкспрессии NUDT13 на чувствительность клеток к подавлению синтеза NAD ингибитором FK866
  • 3.4. Сравнение метаболической активности контрольных клеток и клеток со стабильной сверхэкспрессией NUDT13 в условиях подавления синтеза NAD ингибитором FK866
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ