Details

Сегодня технология мРНК-вакцин является одной из наиболее перспективных платформ ввиду возможности оперативно реагировать на новые и быстро мутирующие патогены. Для улучшения эффективности трансляции синтетических мРНК применяют комплексные подходы: изменение длины поли(А)-последовательности, добавление модифицированных нуклеотидов, 5’-кэп, участков 5’- и 3’- нетранслируемых областей (UTRs), внутреннего сайта посадки рибосомы (IRES). Данная работа посвящена получению методом in vitro транскрипции (IVT) оптимизированных молекул мРНК, кодирующих последовательность зеленого флуоресцентного белка (eGFP), с последующей оценкой их трансляционной активности. В рамках данной работы был выполнен дизайн оригинальных генетических конструкций, кодирующих ген eGFP, с и без 5’- и 3’-UTRs гена α-глобина человека, с и без IRES, с и без последовательности Козак, с и без сегментированной поли(А)-структуры. Методом молекулярного клонирования были получены плазмидные ДНК в клетках Escherichia coli штамма DH5α. Были синтезированы мРНК методом IVT и оценена их биологическая активность в клетках BHK-21. Все полученные мРНК были успешно трансфецированы и транслированы. Наибольшая трансляционная активность показана для мРНК с элементами 5- и 3ʹ-UTRs гена α глобина человека, полученных при линеаризации матрицы сразу после вставки, с сегментированной поли(А)-структурой размером 60 п.н. Данные результаты могут быть использованы для получения вакцинных мРНК.

Today, mRNA vaccine technology is one of the most promising platforms due to the ability to respond quickly to new and rapidly mutating pathogens. Complex approaches are used to improve the translation efficiency of synthetic mRNAs: changing the length of poly(A)-sequence, adding modified nucleotides, 5-caps, 5- and 3-untranslated regions (UTRs), internal ribosome entry site (IRES). This work is devoted to the preparation by in vitro transcription (IVT) of optimized mRNA molecules encoding the green fluorescent protein (eGFP) sequence and subsequent evaluation of their translational activity. This work involved the design of original genetic constructs encoding the eGFP gene, with and without 5- and 3-UTRs of the human α-globin gene, with and without IRES, with and without Kozak sequence, with and without segmented poly(A)-structure. Plasmid DNAs were prepared in Escherichia coli cells of strain DH5α by molecular cloning method. The mRNAs were synthesized by IVT method and their biological activities were evaluated in BHK-21 cells. All the obtained mRNAs were successfully transfected and translated. The highest translational activity was shown for mRNAs with 5- and 3ʹ-UTRs elements of the human α-globin gene, obtained by linearization of the matrix immediately after insertion, with a segmented poly(A)-structure of 60 bp in size. These results can be used to produce vaccine mRNAs.