Details

В первой главе работы приведено описание процесса SOS ответа, теория о белках RecA и RecN. Во второй главе описаны методы: анализ сдвига электрофоретической подвижности ДНК в присутствии белков, сборка генетических конструкций, трансформация бактерий, редактирования генома бактерий с помощью системы CRISPR-Cas9, флуоресцентная микроскопия. В третьей главе представлены результаты исследования. Удалось оценить ДНК-связывающую способность белков RecN и RecA отдельно и совместно. Были созданы генетические конструкции на основе системы CRISPR-Cas9, которые позволили получить штамм с генами recA и recN, слитыми с генами флуоресцентных белков. Были получены изображения, отображающие локализацию белков RecA и RecN в нормальных условиях и во время SOS-ответа. Главные выводы из работы: при добавлении в реакцию сразу двух бел-ков RecA и RecN связывание всех форм ДНК улучшается; в нормальных условиях белок RecN в клетке отсутствует, а белок RecA активно перемещается по клетке. В состоянии SOS-ответа белок RecA образует филаменты внутри клеток, белок RecN образует фокусы, которые в некоторых случаях колокализуются с фокусами RecA, а в некоторых случаях располагаются от-дельно. При этом белка RecN в клетках гораздо меньше, чем белка RecA.

The first chapter describes the process of SOS response, the theory of RecA and RecN proteins. The second chapter describes materials and methods: analysis of DNA elec-trophoretic mobility shift in the presence of proteins, assembly of genetic con-structs, bacterial transformation, bacterial genome editing using CRISPR-Cas9 sys-tem, fluorescence microscopy. The third chapter presents the results of the study. The DNA-binding ability of RecN and RecA proteins separately and together was evaluated. Genetic con-structs based on the CRISPR-Cas9 system were created, which allowed to obtain a strain with recA and recN genes fused with the genes of fluorescent proteins. Imag-es showing the localization of recA and recN proteins under normal conditions and during the SOS response were obtained. The main conclusions of the work: 1) when two RecA and RecN proteins are added to the reaction at once, the binding of all forms of DNA is improved; 2) un-der normal conditions, RecN protein is absent in the cell, while RecA protein is ac-tively moving around the cell. During SOS response, the RecA protein forms fila-ments inside cells, the RecN protein also forms foci, which in some cases are colo-calized with RecA foci, and in some cases are located separately. At the same time, there is much less RecN protein in cells than RecA protein.