Details

Цель работы: исследовать влияние методов индукции на уровень синтеза рекомбинантного белка RelSeq, а также исследовать влияние условий культивирования на рост штаммов Saccharomyces cerevisiae. Задачи: 1. Выполнить трансформацию клеток Escherichia coli плазмидой pET21, кодирующей N-концевой фрагмент, содержащий 385 первых аминокислот нативного белка RelSeq. 2. Провести наработку N-концевого фрагмента белка RelSeq, индуцировав его синтез методами внесения индуктора и автоиндукции. 3. Сравнить эффективность использования разных методов индуцирования экспрессии рекомбинантного белка в E. coli. 4. Изучить влияние условий поверхностного культивирования дрожжей S. cerevisiae на морфологические свойства колоний. Объекты исследования – бактерии Escherichia coli штамм BL21 DE3 (Gold), винные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Работа была выполнена на базе лаборатории молекулярной биологии и нейтронных исследований НИЦ «Курчатовский институт» - ПИЯФ. При сравнении эффективности методов индуцирования синтеза белка RelSeq учитывали массу полученной клеточной культуры и количество целевого продукта, которое оценивалось методом электрофоретического анализа. При изучении влияния условий поверхностного культивирования дрожжей S. cere-visiae на морфологические свойства колоний анализируемыми показателями являлись размер дрожжевых колоний, их форма, цвет и структура края В ходе работы был сделан вывод о том, что метод автоиндукции экспрессии рекомбинантного белка обладает большей эффективностью, так как доля целевого белка, получаемого данным способом, больше доли того же белка, получаемого при использовании индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Кроме того, метод автоиндукции требует меньших временных затрат. В ходе проведенных исследований на примере штаммов Б1, Б2, Б72 было показано, что для культивирования дрожжей-сахаромицетов не выявлено различий между средами, содержащими глюкозу, сахарозу и мальтозу. Эффективный рост колоний наблюдается на средах с глицерином, рафинозой, галактозой и этиловым спиртом, однако неровный край колоний может свидетельствовать о недостатке питательных веществ. Также было установлено, что оптимальная температура культивирования дрожжей-сахаромицетов составляет от плюс 20 ºC до плюс 30 ºC.

The aim of the work was to investigate the effect of induction methods on the level of synthesis of the recombinant RelSeq protein, as well as to investigate the effect of cultivation conditions on the growth of Saccharomyces cerevisiae strains. Tasks: 1. Perform transformation of Escherichia coli cells with a plasmid, pET21, en-coding an N-terminal fragment containing the 385 first amino acids of the native RelSeq protein. 2. To develop the N-terminal fragment of the RelSeq protein by inducing its syn-thesis using methods of introducing an inductor and auto-induction. 3. To compare the effectiveness of using different methods of inducing recombi-nant protein expression in E. coli. 4. To study the effect of surface cultivation conditions of S. cerevisiae yeast on the morphological properties of colonies. The objects of research are Escherichia coli bacteria strain BL21 DE3 (Gold), wine yeast Saccharomyces cerevisiae. The work was performed based on the Laboratory of Molecular Biology and Neu-tron Research of the Kurchatov Institute Research Center. When comparing the effec-tiveness of methods for inducing RelSeq protein synthesis, the mass of the resulting cell culture and the amount of the target product were considered, which was evaluated by electrophoretic analysis. When studying the effect of surface cultivation conditions of S. cerevisiae yeast on the morphological properties of colonies, the analyzed indicators were the size of yeast colonies, their shape, color, and edge structure In the course of the work, it was concluded that the method of auto-induction of recombinant protein expression is more effective, since the proportion of the target protein obtained by this method is greater than the proportion of the same protein ob-tained using the isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducer. In addition, the auto-induction method requires less time. During the conducted studies, using the example of strains B1, B2, and B72, it was shown that for the cultivation of saccharomyces yeast, no differences were found between media containing glucose, sucrose, and maltose. Effective colony growth is observed in the media with glycerin, raffinose, galactose, and ethyl alcohol, however, the uneven edge of the colonies may indicate a lack of nutrients. It was also found that the optimal temperature of saccharomyces yeast cultivation ranges from plus 20 °C to plus 30 °C.

• РЕФЕРАТ
• ВВЕДЕНИЕ
• 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
  • 1.1. Применение Escherichia coli в биотехнологии
  • 1.2. Регуляция экспрессии lac-оперона
  • 1.3. Применение Saccharomyces cerevisiae в биотехнологии
  • 1.4. Использование плазмидного вектора для трансформации E. coli
  • 1.5. Функции белка RelSeq
  • 1.6. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле
• 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • 2.1. Планирование эксперимента
  • 2.2. Материалы и оборудование
  • 2.3. Трансформация клеток E. coli
  • 2.4. Проведение тестовой экспрессии белка RelSeq385 с внесением индуктора
  • 2.5. Проведение экспрессии белка RelSeq с внесением индуктора
  • 2.6. Проведение экспрессии белка RelSeq методом автоиндукции
  • 2.7. Определение уровня экспрессии белка
  • 2.8. Изучение влияния условий культивирования на рост S. cerevisiae
  • 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
  • 3.1. Сравнение эффективности использования разных методов индуцирования экспрессии рекомбинантного белка в E. coli
  • 3.1.1. Результаты идентификации трансформированных клеток
  • 3.1.2. Результаты проведения тест-экспрессии N-концевого фрагмента белка RelSeq385 с внесением индуктора
    • 3.1.3. Результаты проведения экспрессии N-концевого фрагмента белка RelSeq385 с внесением индуктора
    • 3.1.4. Результаты проведения экспрессии N-концевого фрагмента белка RelSeq385 методом автоиндукции
  • 3.2. Результаты исследования влияния условий культивирования на рост дрожжей-сахаромицетов
  • 3.3. Статистическая обработка результатов
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ