Details

Данная работа посвящена изучению свойств бактериальных комплексов SMC с использованием методов флуоресцентной микроскопии. Основная задача заключалась в реализации экструзии петель в микрофлюидных устройствах для изучения свойств комплексов SMC Ureaplasma parvum и Bacillus subtilis на одномолекулярном уровне. В первой главе представлен обзор структуры и функций бактериальных комплексов SMC, механизмов компактизации и сегрегации ДНК, а также современных моделей экструзии петель. Во второй главе описаны созданные и оптимизированные в рамках экспериментов протоколы подготовки образцов для визуализации отдельных молекул ДНК. В третьей главе представлены основные результаты работы. Были созданы стабильные условия для одномолекулярной визуализации, включая оптимизированные буферы и режимы съёмки. Реализована надёжная схема фиксации и растяжения ДНК в микрофлюидном устройстве. После инкубации ДНК с комплексами SMC наблюдалась ее компактизация. Также в настоящей работе нам впервые удалось продемонстрировать предполагаемую экструзию петель комплексом Smc-ScpAB U. parvum. Полученные результаты имеют фундаментальное значение для понимания механизмов организации бактериальной хромосомы и расширяют представления о работе SMC-комплексов у бактерий. Разработанные одномолекулярные методы и оптимизированные микрофлюидные подходы могут быть использованы для дальнейшего изучения хромосомной динамики и свойств белков SMC. При выполнении литературного обзора использовались следующие базы данных: PubMed, Google Scholar, eLIBRARY.RU, Scopus, Web of Science.

This work is devoted to the investigation of the properties of bacterial SMC complexes using fluorescence microscopy. The main objective was to implement loop extrusion in microfluidic devices in order to study the behavior of SMC complexes from Ureaplasma parvum and Bacillus subtilis at the single-molecule level. The first chapter provides an overview of the structure and functions of bacterial SMC complexes, mechanisms of DNA compaction and segregation, as well as current models of loop extrusion. The second chapter describes the sample preparation protocols for single-molecule DNA visualization that were developed and optimized during the experiments. The third chapter presents the main results of the study. Stable conditions for single-molecule visualization were established, including optimized buffers and imaging settings. A reliable method for DNA attachment and stretching in a microfluidic device was implemented. After incubation of DNA with SMC complexes, compaction were observed. Furthermore, in this work we were able to demonstrate, for the first time, the putative loop extrusion activity of the Smc–ScpAB complex from U. parvum. The obtained results are of fundamental importance for understanding the mechanisms of bacterial chromosome organization and broaden current knowledge about the functioning of SMC complexes in bacteria. The developed single-molecule methods and optimized microfluidic approaches can be used for further studies of chromosome dynamics and the properties of SMC proteins. The literature review was carried out using the following databases: PubMed, Google Scholar, eLIBRARY.RU, Scopus, and Web of Science.