Details

Тема выпускной квалификационной работы: «Диагностические параметры разработанной ПЦР тест-системы для молекулярной диагностики поликистоза почек Felis catus». Цель работы заключалась в оценке диагностических параметров ПЦР-РВ тест-системы (ООО «Бигль» (г. Санкт-Петербург, РФ)) для ранней молекулярной диагностики поликистоза почек Felis catus по мутации c.10063C>A в гене PKD1 в условиях ограниченной выборки. Объектом исследования выступала ПЦР-РВ тест-система для выявления однонуклеотидного полиморфизма c.10063C>A в гене PKD1, предметом — её диагностические параметры. В ходе работы применяли методы выделения ДНК, молекулярного клонирования, ПЦР в реальном времени с TaqMan-зондами и методы статистической обработки результатов. В работе были определены диагностическая чувствительность и специфичность, прогностические ценности ПЦР-РВ тест-системы для выявления SNP-вариантов гена PKD1 на клиническом уровне с применением доверительных интервалов по методу Уилсона; а также оценена точность идентификации SNP-варианта генотипирования ПЦР-РВ тест-системы на многоклассовом уровне с использованием коэффициента каппа Коэна. Результаты подтвердили диагностическую значимость ПЦР-РВ тест-системы для выявления мутации c.10063C>A в гене PKD1. Было показано, что использование рекомбинантных плазмид позволяет проводить оценку тест-системы при дефиците нативного биоматериала и моделировать аллельное состояние, ассоциированное с гибелью  эмбрионов на ранних стадиях развития. ПЦР-РВ тест-система корректно дифференцировала три аллельных состояния гена PKD1 и показала высокие значения диагностической чувствительности и специфичности в условиях ограниченной выборки. Обоснована целесообразность применения двухуровневого статистического подхода для объективной оценки диагностических параметров ПЦР-РВ тест-систем на малых выборках. Полученные результаты могут быть использованы при последующей валидации и внедрении ПЦР-РВ тест-системы в ветеринарную лабораторную практику, а также при организации молекулярно-генетического скрининга поликистоза почек у кошек. Литературный обзор подготовлен на основе публикаций из баз PubMed, Scopus, eLIBRARY, ScienceDirect и библиотеки СПбПУ. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программного обеспечения Microsoft Excel и IBM SPSS Statistics.

The topic of the thesis is: "Diagnostic parameters of the developed PCR assay for the molecular diagnosis of polycystic kidney disease in Felis catus". The aim of the work was to evaluate the diagnostic parameters of a real-time PCR assay (Beagle LLC, St. Petersburg, Russia) for the early molecular diagnosis of polycystic kidney disease in Felis catus targeting the c.10063C>A mutation in the PKD1 gene, using a limited sample size. The object of the study was the real-time PCR assay for detecting the c.10063C>A single nucleotide polymorphism in the PKD1 gene; the subject of the study was its diagnostic parameters. Methods applied during the research included DNA extraction, molecular cloning, real-time PCR with TaqMan probes, and statistical data analysis. The study determined the diagnostic sensitivity, diagnostic specificity, and predictive values of the real-time PCR assay for detecting SNP variants of the PKD1 gene at the clinical level, using Wilson score confidence intervals. Furthermore, the genotyping accuracy of the real-time PCR assay for identifying SNP variants was evaluated at a multiclass level using Cohens kappa coefficient. The results confirmed the diagnostic significance of the real-time PCR assay for detecting the c.10063C>A mutation in the PKD1 gene. It was demonstrated that the use of recombinant plasmids allows for the evaluation of the assay in the event of a shortage of native biological samples and enables the modeling of the allelic state associated with early embryonic lethality. The real-time PCR assay correctly differentiated three allelic states of the PKD1 gene and demonstrated high diagnostic sensitivity and specificity values under limited sample conditions. The expediency of applying a two-level statistical approach for the objective evaluation of the diagnostic parameters of real-time PCR assays on small samples was justified. The obtained results can be utilized for the subsequent validation and implementation of the real-time PCR assay into veterinary laboratory practice, as well as for the organization of molecular genetic screening for polycystic kidney disease in cats. The literature review was prepared based on publications from the PubMed, Scopus, eLIBRARY, and ScienceDirect databases, as well as the SPbPU library. Statistical data processing was performed using Microsoft Excel and IBM SPSS Statistics software.