Details

Данная работа посвящена изучению белкового комплекса MukBEF E. coli. Цель работы: комплексно исследовать биохимические свойства комплекса MukBEF и выявить его белковых партнеров in vitro и in vivo. Методы: металл-аффинная хроматография, метод малахитового зеленого для анализа АТФазной активности, анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA), со-осаждение белков, флуоресцентная двугибридная система. Полученные результаты: MukEF стимулирует АТФазную активность MukB; MukB активнее связывает двунитевую кольцевую ДНК; MukE и MukF ослабляют связывание MukB с ДНК, при этом связывают ДНК независимо; впервые обнаружено со-осаждение MukB с белками GltA, TufA, FusA и выявлена тенденция к in vivo взаимодействию MukE с FusA и TufA. Выводы: экспериментально опровергнуты литературные данные об отсутствии ДНК связывающей активности MukEF, предпочтительном сродстве комплекса MukBEF к однонитевой ДНК и об ингибирующем эффекте MukE на АТФазу MukB. Впервые обнаружена связь комплекса с цитратсинтазой и факторами трансляции. Результаты могут быть использованы в области молекулярной биологии для пересмотра принципов компактизации бактериального генома. В работе использовано ПО: ImageJ, OriginPro, SnapGene, базы данных PDB.

The given work is devoted to the study of the MukBEF protein complex of E. coli. The aim of the work is to comprehensively investigate the biochemical properties of the MukBEF complex and to identify its protein partners in vitro and in vivo. Methods: metal-affinity chromatography, malachite green assay for ATPase activity analysis, electrophoretic mobility shift assay (EMSA), protein co-precipitation, fluorescent bacterial two-hybrid system. Results obtained: MukEF stimulates the ATPase activity of MukB; MukB binds double-stranded circular DNA more efficiently; MukE and MukF weaken the binding of MukB to DNA and bind DNA independently; for the first time, co-sedimentation of MukB with GltA, TufA, and FusA proteins was detected, and a tendency toward in vivo interaction of MukE with FusA and TufA was revealed. Conclusions: literature data regarding the lack of DNA-binding activity of MukEF, the preferential affinity of the MukBEF complex for single-stranded DNA, and the inhibitory effect of MukE on MukB ATPase have been experimentally disproved. A connection between the complex and citrate synthase as well as translation factors was discovered for the first time. The results can be applied in molecular biology to revise the principles of bacterial genome compactization. Software used in the work: ImageJ, OriginPro, SnapGene, and PDB database.