Details

Данная  работа  посвящена  преодолению  резистентности  клеток аденокарциномы  толстой  кишки  человека  HCT116  к  оксалиплатину.  Для восстановления чувствительности использован аденовирусный белок Е1А. Целью  работы  было  оценить  влияние  активации  клеточного  цикла, индуцированной  аденовирусным  белком  E1A,  на  чувствительность  клеток аденокарциномы толстой кишки человека линии HCT116 к оксалиплатину. Методами  лентивирусной  трансдукции  получены  линии  с индуцируемой  экспрессией  Е1А  НСТ116-E1A  и  резистентная  суб-линия НСТ116-ОХ-E1A.  Жизнеспособность  оценивали  МТТ-тестом  и  окраской кристаллическим  фиолетовым,  распределение  по  фазам  цикла  определяли проточной  цитометрией,  экспрессию  генов  оценивали  по  результатам ПЦР-РВ на уровне мРНК и иммуноблоттинга на уровне белка. Было  доказано,  что  собственная  экспрессия  Е1А  усиливает  действие оксалиплатина,  восстанавливая  чувствительность резистентной линии. Е1А также  вызывает  накопление  клеток  в  S-фазе,  указывая  на  реактивацию клеточного  цикла.  На  молекулярном  уровне  Е1А  повышает  транскрипцию E2F1,  циклинов  А,  В,  Е  и  подавляет  ингибиторы  p21/p27,  отменяя p53-опосредованный ответ на повреждение ДНК. Результаты демонстрируют возможность преодоления резистентности к оксалиплатину путём модуляции клеточного цикла.

The given work is devoted to overcoming the resistance of human colorectal adenocarcinoma HCT116 cells to oxaliplatin. Adenoviral protein E1A was used to restore sensitivity. The  aim  of  the  work  was  to  evaluate  the  effect  of  cell  cycle  activation induced  by  adenoviral  protein  E1A  on  the  sensitivity  of  human  colorectal adenocarcinoma HCT116 cells to oxaliplatin. Using  lentiviral  transduction,  lines  with  inducible  E1A  expression  were obtained  based  on  the  parental  HCT116  cell  line  and  the  resistant  subline HCT116‑OX. Viability was assessed by MTT assay and crystal violet staining, cell cycle  distribution  was  determined  by  flow cytometry, and gene expression was evaluated by RT‑PCR at the mRNA level and by immunoblotting at the protein level. It was demonstrated that E1A expression enhances the effect of oxaliplatin, restoring the sensitivity of the resistant line. E1A also causes cell accumulation in S phase, indicating cell cycle reactivation. At the molecular level, E1A increases the  transcription  of  E2F1,  cyclins  A,  B,  and  E,  and  suppresses  the  inhibitors p21/p27, abolishing the p53‑mediated DNA damage response. The results demonstrate the possibility of overcoming oxaliplatin resistance through cell cycle modulation.

• СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • 1.1. Колоректальный рак
  • 1.2. Химиотерапия: препараты платины
  • 1.3. Лекарственная устойчивость
  • 1.4. Аденовирусный белок Е1А
• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  • 2.1. Культивирование клеточных линий
  • 2.2. Паковка лентивирусных частиц с плазмидой Tet-ONE-E1A
  • 2.3. Лентивирусная трансдукция E1A в клетки HCT116
  • 2.4. Селекция клеток после лентивирусной трансдукции
  • 2.5. Выделение РНК из монослоя клеток
  • 2.7. Обратная транскрипция
  • 2.8. Полимеразная цепная реакция
  • 2.9. Выделение клеточных экстрактов
  • 2.10. Приготовление белковых проб
  • 2.11. Диск-электрофорез по Лэммли (SDS-PAGE)
  • 2.12. Электроблоттинг
  • 2.13. Иммуноблоттинг
  • 2.14. МТТ-тест
  • 2.15. Окраска клеток кристаллическим фиолетовым
  • 2.16. Проточная цитофлуориметрия
  • 3.1. Получение и характеристика клеточной линии HCT116 с индуцибельной экспрессией гена E1A
  • 3.2. Влияние экспрессии белка E1A на на пролиферативную активность и жизнеспособность клеток HCT116-E1A и HCT116-OX-E1A под действием оксалиплатина
  • 3.3. Влияние экспрессии белка E1A и оксалиплатина на распределение клеток по фазам клеточного цикла
  • 3.4. Молекулярные механизмы сенсибилизации клеток к оксалиплатину под действием белка E1A: анализ экспрессии ключевых регуляторов клеточного цикла
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ