Details

Работа посвящена получению стабильной клеточной линии HEK‑293, эктопически экспрессирующей субъединицу NDUFS1 митохондриального комплекса I, и оценке ее пролиферативной активности. В ходе исследования проведены: амплификация кДНК NDUFS1, клонирование ее в лентивирусный вектор pLVTHM-ires-Puro, верификация клонирования рестрикцией и секвенированием, получение лентивирусных частиц, содержащих вектор с кДНК NDUFS1, трансдукция ими клеток HEK-293T и селекция на пуромицине, подтверждение экспрессии белка методами иммуноцитохимии и иммуноблоттинга, оценка пролиферации клеток методом проточной цитометрии. Клонирована кДНК NDUFS1 в лентивирусный вектор, получена конструкция pLVTHM-NDUFS1-ires-Puro. Подтверждена митохондриальная локализация белка и наличие дублета на иммуноблоттинге (эндогенный ~75 кДа и рекомбинантный ~76 кДа с T7-tag). Клетки с NDUFS1 не показали ускорения пролиферации – напротив, контрольные клетки росли статистически значимо быстрее через 24 и 48 ч (p <0,05). Результаты могут быть использованы в исследованиях роли митохондриального комплекса I в регуляции клеточной пролиферации.

This work is devoted to obtaining a stable HEK-293T cell line overexpressing the S1 subunit of mitochondrial сomplex I (NDUFS1) and assessing the effect on cell proliferation. Methods: NDUFS1 cDNA amplification; cloning into pLVTHM-ires-Puro, plasmid verification by restriction analysis and sequencing, lentiviral particle production, HEK-293T transduction and puromycin selection, protein expression confirmed by immunocytochemistry and Western blot, proliferation assessed by flow cytometry. The recombinant plasmid pLVTHM-NDUFS1 was verified. Mitochondrial localization and a doublet on Western blot (~75 kDa endogenous, ~76 kDa recombinant with T7-tag) were confirmed. NDUFS1-expressing cells did not show accelerated proliferation; conversely, control cells grew significantly faster at 24 and 48 h (p < 0.05). The results can be used in further studies of mitochondrial сomplex I in cell proliferation.

• СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • 1.1. Структура и функция дыхательной цепи митохондрий
  • 1.2. Комплекс I (НАДН-убихинон-оксидоредуктаза)
  • 1.3. Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа)
  • 1.4. Комплекс III (цитохром bc1-комплекс)
  • 1.5. Комплекс IV (цитохром c оксидаза)
  • 1.6. Подвижные переносчики: убихинон и цитохром c
  • 1.7. Комплекс V (АТФ-синтаза) и протонный градиент
  • 1.8. Митохондриальный комплекс I: структура, каталитическое ядро и роль в патологии
  • 1.9. Клиническая значимость NDUFS1: синдром Лея
  • 1.10. Каталитический цикл комплекса I
  • 1.11. NDUFS1: от митохондриальной дисфункции к регуляции пролиферации
  • 1.12. NDUFS1 как драйвер пролиферации: механизм действия
• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  • 2.1. Клонирование рекомбинантной плазмиды pLVTHM‑NDUFS1
  • 2.1.1 Генетические конструкции
  • 2.1.2. Полимеразная цепная реакция
  • 2.1.3. Электрофоретическое разделение ПЦР-продукта в агарозном геле
  • 2.1.4. Выделение ДНК из агарозного геля
  • 2.1.5. Рестрикция очищенного ПЦР-продукта и плазмидного вектора
  • 2.1.6. Лигирование гена NDUFS1 и лентивирусного вектора
  • 2.1.7. Трансформация плазмидной ДНК клеток E.coli методом теплового шока в присутствии хлорида кальция
  • 2.1.8. Отбор и анализ клонов после трансформации E. coli методом ПЦР
  • 2.1.9. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
  • 2.1.10. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК
  • 2.1.11. Секвенирование плазмидной ДНК
  • 2.2. Методы работы с культурами эукариотических клеток
  • 2.2.1. Культивирование клеток HEK-293T
  • 2.2.2. Паковка лентивирусов с помощью PEI
  • 2.2.3. Трансдукция клеток HEK-293T
  • 2.2.4. Цитохимический анализ
  • 2.2.5. Иммуноблоттинг
  • 2.2.6. Анализ пролиферации клеток с помощью проточной цитометрии
• ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
  • 3.1. Клонирование кДНК NDUFS1 в вектор pLVTHM‑Ires-Puro
  • 3.1.1. Проверка последовательности вектора pUC19‑NDUFS1 с помощью рестрикционного анализа
  • 3.1.2. Рестрикция фрагмента кДНК NDUFS1, вектора pLVTHM‑Ires-Puro и их последующее лигирование
  • 3.1.3. Трансформация E. coli продуктами лигирования и отбор клонов
  • 3.1.4. Выделение плазмидной ДНК (miniprep) и рестрикционный анализ
  • 3.2. Получение стабильной клеточной линии HEK-293T, экспрессирующей NDUFS1
  • 3.2.1. Сборка лентивирусных частиц
  • 3.2.2. Трансдукция и селекция клеток HEK-293T
  • 3.3. Оценка экспрессии NDUFS1 и пролиферативной активности клеток HEK-293T, экспрессирующих целевой трансген
  • 3.3.1. Анализ экспрессии трансгена NDUFS1 с помощью иммуноцитохимического окрашивания
  • 3.3.2. Анализ экспрессии трансгена NDUFS1 с помощью иммуноблоттинга
  • 3.3.3. Анализ пролиферации клеток HEK-293T методом проточной цитометрии
• ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
  • 4.1. Успешное клонирование и верификация рекомбинантной плазмиды
  • 4.2. Экспрессия, локализация и детекция рекомбинантного NDUFS1
  • 4.3. Влияние экспрессии NDUFS1 на пролиферацию
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
• БЛАГОДАРНОСТИ