Details

Данная работа посвящена разработке и получению модельной генетической конструкции на основе гена люциферазы светлячка (Firefly luciferase, FFluc) для производства синтетической мРНК методом транскрипции in vitro (IVT). Задачи, которые решались в ходе исследования: -анализ научной литературы по структуре и применению мРНК, свойствам люциферазы и методам молекулярной биологии; -дизайн генетической конструкции, кодирующей ген FFluc и содержащей 5- и 3-нетранслируемые области гена мыши (UTR) и последовательность Козак; -получение методом молекулярного клонирования промежуточной конструкции pAL2-T-FFluc-mUTR в клетках Escherichia coli штамма DH5α; -получение целевой оригинальной генетической конструкции pIRESneo3-FFluc-mUTR в клетках E. coli DH5α; -синтез мРНК методом IVT с применением модифицированных нуклеотидов (псевдоуридин, 5-метилцитидин) и кэп-аналога ARCA, а также оценка эффективности трансфекции на клеточных культурах ВНК-21. Объект исследования – плазмидные векторы pAL2-T и pIRESneo3, ген FFluc, штамм E. coli DH5α. Работа выполнена на базе лаборатории внутриклеточного сигналинга и транспорта ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России. Анализируемыми параметрами являлись оценка успешности клонирования гена FFluc методами ПЦР с колоний и рестрикционным анализов плазмидных ДНК (пДНК), концентрация пДНК и синтезированной мРНК, а также уровень биолюминесценции после трансфекции клеток. В ходе исследования разработаны и сконструированы генетические конструкции pAL2-T-FFluc-mUTR и pIRESneo3-FFluc-mUTR; получены штаммы-продуценты E. coli DH5α, несущие данные плазмиды. Проведён синтез мРНК с модифицированными нуклеотидами и кэп-аналогом ARCA; после полиаденилирования получена матричная РНК. Подтверждена функциональная активность синтезированной мРНК в клетках ВНК-21 по интенсивности биолюминесценции. Созданная модельная конструкция может служить стандартным инструментом для оценки эффективности трансляции и доставки мРНК в доклинических исследованиях. При написании литературного обзора использовались базы данных: eLIBRARY.RU, cyberleninka.ru, Scopus, PubMed. Биоинформационный анализ проводился с использованием онлайн-ресурса PrimerBlast и набора программ SnapGene 8.1 и UGENE.

This work is devoted to the development and production of a model genetic construct based on the firefly luciferase gene (FFluc) for the production of synthetic mRNA by in vitro transcription (IVT). Tasks that were solved in the course of the study: -analysis of scientific literature on the structure and application of mRNA, properties of luciferase, and molecular biology methods; -design of a genetic construct encoding the FFluc gene and containing the 5- and 3-untranslated regions of the mouse gene (UTR) and a Kozak sequence; -production of the intermediate construct pAL2-T-FFluc-mUTR in Escherichia coli DH5α cells using molecular cloning methods; -production of the target original genetic construct pIRESneo3-FFluc-mUTR in E. coli DH5α cells; -synthesis of mRNA by in vitro transcription (IVT) using modified nucleotides (pseudouridine, 5-methylcytidine) and the ARCA cap analog, as well as evaluation of transfection efficiency on BHK-21 cell cultures. Object of research – plasmid vectors pAL2-T and pIRESneo3, the FFluc gene, and E. coli strain DH5α. The work was carried out at the Laboratory of Intracellular Signaling and Transport of the Smorodintsev Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian Federation. The analyzed parameters were assessment of the success of FFluc gene cloning using colony PCR and restriction analysis of plasmid DNA (pDNA), concentration of pDNA and synthesized mRNA, as well as the level of bioluminescence after cell transfection. During the research, the genetic constructs pAL2-T-FFluc-mUTR and pIRESneo3-FFluc-mUTR were developed and constructed; producer strains of E. coli DH5α carrying these plasmids were obtained. mRNA synthesis was performed using modified nucleotides and the ARCA cap analog; after polyadenylation, the mature mRNA was obtained. The functional activity of the synthesized mRNA in BHK-21 cells was confirmed by bioluminescence intensity. The resulting model construct can serve as a standard tool for assessing the efficiency of translation and mRNA delivery in preclinical studies.The literature review was conducted using the following databases: eLIBRARY.RU, cyberleninka.ru, Scopus, PubMed. Bioinformatic analysis was performed using the online resource PrimerBlast and set of programs SnapGene 8.1 and UGENE software.