Details

Данная работа посвящена разработке комплексной методики микроскопического анализа для исследования внутриклеточной динамики белков-ингибиторов бактериального роста и апробации разработанной методики на примере белка Gp19 бактериофага phiKZ в составе белков слияния. Задачи, которые решались в ходе исследования: – описание механизмов действия и структурных особенностей белков-ингибиторов бактериального роста фагового происхождения; – конструирование плазмиды pHERDmNGGp19 методом Гибсона; – разработка комплексной методики микроскопического анализа белков-ингибиторов бактериального роста; – апробация разработанной методики на примере белка Gp19 бактериофага phiKZ в составе белков слияния; – проведена оценка влияния белка Gp19 бактериофага PhiKZ в составе белков слияния на бактериальные клетки. Объектами исследования являются клетки Escherichia coli штамма DH5α, синтезирующие белок Gp19 бактериофага phiKZ, слитый со стреп-тагом, а также клетки, синтезирующие белок Gp19, слитый с флуоресцентным белком mNeonGreen. Предметом исследования является оценка влияния белка Gp19 бактериофага phiKZ, слитого со стреп-тагом или с флуоресцентным белком, на жизнеспособность клеток. Работа выполнена на базе научно-исследовательского комплекса «Нанобиотехнологии» Института биомедицинских систем и биотехнологий Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого. В ходе исследования была разработана методика микроскопического анализа белков ингибиторов бактериального роста. На основе разработанной методики была проведена флуоресцентная микроскопия клеток E.coli, синтезирующих белки слияния strGp19 и mNGGp19. Было установлено, что в обоих случаях, клетки, которые синтезировали белок слияния на подложке с индуктором, проходили лишь 1 деление до 1 часа съемки. В то же время контрольные образцы на подложке с индуктором делились на протяжении всего времени эксперимента. Были подсчитаны доли мертвых клеток: для strGp19 через 10 часов съемки на подложке с индуктором доля составила ~80%, без индуктора – 51%, для его контролей – 9% и 7% соответственно. Для mNGGp19 через 10 часов съемки на подложке с индуктором доля составила ~86%, без индуктора – 52%, для его контролей – 13% и 22% соответственно. Для обзора литературы по теме исследования использованы базы данных с учетом основных требований информационной безопасности: eLIBRARY, КиберЛенинка, ScienceDirect, ResearchGate, PubMed, Google Scholar. Для конструирования плазмиды in silico использовать облачную платформу Benchling. Для обработки изображений, полученных в ходе флуоресцентной микроскопии, использовано программное обеспечение ImageJ.

This study is devoted to the development of a comprehensive method for microscopic analysis aimed at investigating the intracellular dynamics of bacterial growth-inhibiting proteins, and to the validation of this method using the Gp19 protein of phiKZ bacteriophage as part of a fusion protein. The tasks of the study: – Description of the mechanisms of action and structural features of the phage bacterial growth-inhibiting proteins; – Construction of the pHERDmNGGp19 plasmid using the Gibson method; – Development of a comprehensive methodology for the microscopic analysis of the bacterial growth-inhibiting proteins; – Validation of the developed methodology using the Gp19 protein of phiKZ bacteriophage as part of the fusion protein; – Evaluation of the effect of the Gp19 protein of phiKZ bacteriophage as part of fusion protein on the bacterial cells. The objects of this study are Escherichia coli DH5α cells that synthesize the Gp19 protein of phiKZ bacteriophage fused to a strep-tag, as well as cells that synthesize the Gp19 protein fused to the fluorescent protein mNeonGreen. The aim of the study is to evaluate the effect of the Gp19 protein of bacteriophage phiKZ, fused with a strep-tag or with a fluorescent protein, on cell viability. This work was carried out at the "Nanobiotechnology" Research Complex of the Institute of Biomedical Systems and Biotechnology at Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University. During the study, a method for the microscopic analysis of bacterial growth-inhibiting proteins was developed. Based on the developed method, fluorescence microscopy was performed on E.coli cells synthesizing the fusion protein strGp19 and mNGGp19. In both cases, the cells that synthesized the fusion protein on a substrate with an inducer underwent only one division before the one-hour imaging period. At the same time, the control samples on the substrate with the inducer continued to divide throughout the entire experiment. The proportions of dead cells were calculated: for strGp19, after 10 hours of exposure on the substrate with an inducer, the proportion was ~80%, without an inducer – 51%, and for its controls – 9% and 7%, respectively. For mNGGp19, after 10 hours of exposure on the substrate with the inducer, the proportion was ~86%, without the inducer – 52%, and for its controls – 13% and 22%, respectively. To review the literature on the research topic, databases were used in accordance with key information security requirements: eLIBRARY, CyberLeninka, ScienceDirect, ResearchGate, PubMed, and Google Scholar. The Benchling cloud platform was used for in silico plasmid design. ImageJ software was used to process the images obtained during fluorescence microscopy.