Details

Предметом исследования выступали аналитические параметры разработанной в ООО «Бигль» ПЦР-РВ тест-системы для выявления аллельного варианта p.R820W гена MYBPC3, ассоциированного с гипертрофической кардиомиопатией (ГКМП) у Felis catus. Цель работы заключалась в комплексной оценке аналитических характеристик ПЦР-РВ тест-системы и подтверждении ее пригодности для молекулярно-генетического скрининга мутации MYBPC3:p.R820W у рэгдоллов и ряда пород. В работе использовали методы выделения геномной ДНК из цельной крови и буккального эпителия, молекулярного клонирования, спектрофотометрии, электрофореза, ПЦР и ПЦР в реальном времени с TaqMan-зондами. Аналитическую оценку проводили с использованием сконструированных рекомбинантных плазмидных контролей и препаратов геномной ДНК кошек. Результаты показали, что параметры пробоподготовки (тип биоматериала, объем исходного образца и способ экстракции ДНК) существенно влияют на сходимость, воспроизводимость и робастность ПЦР-РВ. Были установлены варианты подготовки образцов, обеспечивающие стабильную амплификацию и минимальные различия значений порогового цикла (Ct) между техническими повторами, определены аналитическая чувствительность, эффективность и рабочий диапазон Ct ПЦР-РВ тест-системы. Полученные данные могут быть использованы при разработке методов раннего молекулярно-генетического скрининга ГКМП у кошек и их внедрения в ветеринарную практику и в фелинологическую экспертизу. Литературный обзор выполнен с использованием баз PubMed, Scopus, eLIBRARY и ScienceDirect; обработку экспериментальных данных и дизайн тест-системы проводили в Microsoft Excel, LightCycler 96 Software, RealTime_PCR, SnapGene, UGENE, IDT OligoAnalyzer, BLASTn NCBI.

This study focused on analytical parameters of a real-time PCR assay developed by Beagle LLC for detecting the p.R820W allelic variant of the MYBPC3 gene associated with hypertrophic cardiomyopathy (HCM) in Felis catus. This work aimed to comprehensively evaluate analytical characteristics of the real-time PCR assay and confirm its suitability for molecular genetic screening of the MYBPC3:p.R820W mutation in Ragdoll cats and several other breeds. Methods included genomic DNA extraction from whole blood and buccal epithelium, molecular cloning, spectrophotometry, electrophoresis, conventional PCR, and real-time PCR with TaqMan probes. Analytical evaluation was performed using constructed recombinant plasmid controls and feline genomic DNA samples. Results showed that sample preparation parameters, including biological material type, initial sample volume, and DNA extraction method, substantially affected repeatability, reproducibility, and robustness of real-time PCR. Sample preparation variants ensuring stable amplification and minimal differences in threshold cycle (Ct) values between technical replicates were established. Analytical sensitivity, efficiency, and working Ct range of the real-time PCR assay were also determined. Obtained data may be used to develop methods for early molecular genetic screening of HCM in cats and to implement them in veterinary practice and felinological expertise. Literature review was conducted using PubMed, Scopus, eLIBRARY, and ScienceDirect databases. Experimental data processing and assay design were performed using Microsoft Excel, LightCycler 96 Software, RealTime_PCR, SnapGene, UGENE, IDT OligoAnalyzer, and BLASTn NCBI.