Details

В  работе    исследовали  влияние  направленной  хемогенетической модуляции активности астроцитов гиппокампа, экспрессирующих рецептор hM3D(Gq), на когнитивные функции и морфологию астроцитов у мышей с генетической  моделью  болезни  Альцгеймера  линии  5xFAD  в  возрасте  8 месяцев.  На клеточной линии HEK 293T подтверждена функциональность конструкта      hM3D(Gq):      активация      клозапин-N-оксидом      вызывает высвобождение  ионов  Ca²⁺  из  внутриклеточных  депо,  так  как  в  ходе эксперимента  использовали  тапсигаргин,  который  является  ингибитором SERCA-АТФазы,  который  опустошает  эндоплазматический  ретикулум.  В поведенческих  тестах  на  условно-рефлекторное  замирание  и  “водный лабиринт  Морриса”  показано,  что  ежедневная  стимуляция  астроцитов восстанавливает  контекстуальную  и  пространственную  память  у  мышей 5xFAD  до  уровня  мышей  дикого  типа.  Иммуногистохимический  анализ выявил снижение GFAP-положительной площади в группе 5xFAD+hM3D по сравнению с контролем. С помощью конфокальной микроскопии и анализа Шолля  установлено,  что  активация  hM3D(Gq)  нормализует  морфологию астроцитов: восстанавливает профиль ветвления, суммарную протяжённость отростков, площадь, занимаемую астроцитом, и количество узлов ветвления. У  мышей  дикого  типа  стимуляция  не  вызывает  негативных  изменений. Полученные        результаты        свидетельствуют  о перспективности хемогенетической  модуляции  активности  астроцитов  в  терапии  болезни Альцгеймера.

In this study, we investigated the effect of targeted chemogenetic modulation of hippocampal astrocyte activity expressing the hM3D(Gq) receptor on cognitive functions and astrocyte morphology in 8-month-old 5xFAD mice, a genetic model of  Alzheimers  disease.  The  functionality  of  the  hM3D(Gq)  construct  was confirmed  in HEK 293T cells: activation with clozapine-N-oxide induced Ca²⁺ release from intracellular stores, as thapsigargin, an inhibitor of SERCA ATPase that  depletes  the  endoplasmic  reticulum,  abolished  the  calcium  response. Behavioral tests: contextual fear conditioning and Morris water maze demonstrated that daily astrocyte stimulation restored contextual and spatial memory in 5xFAD mice to the level of wild-type animals. Immunohistochemical analysis revealed a reduction  in  the  GFAP-positive area in the 5xFAD+hM3D group compared to control.  Confocal  microscopy  and  Sholl  analysis  showed  that  hM3D(Gq) activation  normalizes  astrocyte  morphology by restoring the branching profile, total process length, area occupied by the astrocyte and the total number of branch nodes. No adverse effects of stimulation were observed in wild-type mice. Our findings suggest that chemogenetic modulation of astrocyte activity represents a promising approach for the therapy of Alzheimers disease.

• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • 1.1. Болезнь Альцгеймера
  • 1.2. Астроциты в норме и при патологии.
  • 1.3. Таргетный контроль над активностью астроцитов
  • 1.4. Изучение когнитивных функций лабораторных животных поведенческим тестированием
• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  • 2.1. Работа с клеточной линией НЕК 293Т
  • 2.2. Трансфекция клеточной линии НЕК 293Т
  • 2.3. Кальциевая имаджинг
  • 2.4. Животные для исследования
  • 2.5. Генотипирование
  • 2.6. Доставка вирусных конструкций
  • 2.7. Внутрибрюшинные инъекции CNO
  • 2.8. Тест на условно-рефлекторное замирание (УРЗ)
  • 2.9. Тест Водный лабиринт Морриса (ВЛМ)
  • 2.10. Подготовка фиксированных срезов
  • 2.11. Иммуногистохимическое исследование реактивности астроцитов
  • 2.12. Конфокальная микроскопия
  • 2.13. Анализ Шолля и морфологический анализ ветвления астроцитов
  • 2.14. Статистика
• ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
  • 3.1. Анализ кальциевой динамики в клетках HEK293T после активации hM3D(Gq) при разных концентрациях кальция во внешней среде, а также при опустошении кальциевого депо клеток
    • 3.1.1. Кальциевая динамика в клетках HEK293T, экспрессирующих hM3D(Gq), при физиологических условиях (2 мM Ca²⁺) во внеклеточной среде после добавления CNO
    • 3.1.2. Кальциевая динамика в клетках HEK293T, экспрессирующих hM3D(Gq), при условиях 0 мM Ca²⁺ во внеклеточной среде после добавления CNO
    • 3.1.3. Изменение концентрации кальция в условиях истощения внутриклеточного депо и 0 мM Ca²⁺ во внеклеточной среде после добавления CNO
    • 3.1.4. Сравнительный анализ интенсивности флуоресценции при изменении концентрации кальция у клеточной линии HEK293T в различных условиях концентрации кальция во внеклеточной среде
  • ​3.2. Изучение влияния направленной стимуляции активности астроцитов у трансгенных мышей линии 5xFAD на когнитивные функции в поведенческом тесте на условно-рефлекторное замирание и “водный лабиринт Морриса”
    • 3.2.1. Поведенческий тест на на условно-рефлекторное замирание
    • 3.2.2. Поведенческий тест “водный лабиринт Морриса”
  • 3.3. Специфическое иммуногистохимическое связывание с глиальным кислым фибриллярным белком (GFAP)
  • ​3.4. Определение влияния активации hM3D(Gq), экспрессированного в астроцитах гиппокампа, на их морфологические характеристики у мышей дикого типа и трансгенных мышей линии 5xFAD
    • 3.4.1. Конфокальные изображения астроцитов гиппокампа контрольных и экспериментальных групп мышей
    • 3.4.2. Количество пересечений (ветвление астроцитов)
    • 3.4.3. Суммарная протяженность всех отростков астроцита
    • 3.4.5. Общее количество узлов
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ