Details

В настоящее время платформа на основе самореплицирующейся РНК (срРНК) рассматривается как одна из наиболее перспективных для разработки вакцин и терапевтических препаратов, что обусловлено её способностью к многократному увеличению числа копий гена целевого белка внутри клетки- мишени. Ключевое отличие срРНК от классических мРНК заключается в наличии дополнительных элементов – последовательностей неструктурных белков альфавирусов (nsP1-nsP4), формирующих репликазный комплекс, а также двух промоторов, осуществляющих регуляцию процессов репликации и трансляции. Целью настоящей работы являлось конструирование плазмидного вектора pVR100₋eGFP, несущего последовательности неструктурных белков nsP1-nsP4 вируса венесуэльского лошадиного энцефаломиелита (VEEV) и гена зелёного флуоресцентного белка (eGFP), для дальнейшего использования в качестве ДНК-матрицы при получении срРНК методом in vitro транскрипции. В ходе исследования был разработан дизайн промежуточного pAL2-T₋eGFP и целевого pVR100₋eGFP плазмидных векторов, содержащих последовательность гена eGFP. Был разработан дизайн оригинальных праймеров для клонирования, методом градиентной ПЦР была подобрана оптимальная температура их отжига и методом гнездовой ПЦР был получен фрагмент eGFP. Методом ТА-клонирования была получена промежуточная конструкция pAL2-T₋eGFP и введена в прокариотические клетки Escherichia coli DH5α. Было выполнено направленное клонирование 4 последовательности eGFP из промежуточного в целевой вектор pVR100 с использованием сайтов рестрикции PacI и PflFI. Отбор клонов был выполнен методом ПЦР-РВ с флуоресцентным зондом и праймерами на ген eGFP, наличие целевого гена в полученных пДНК было подтверждено рестрикционным анализом по сайтам PflFI, PacI и XbaI, а также и секвенированием по Сэнгеру. Полученные результаты могут найти применение при разработке препаратов на основе срРНК.

Currently, the platform based on self-replicating RNA (srRNA) is considered one of the most promising for the development of vaccines and therapeutic agents. This is due to its ability to amplify the copy number of a target protein gene inside the recipient cell multiple times. The key distinction between srRNA and conventional mRNA lies in the presence of additional elements – sequences encoding alphavirus non‑structural proteins (nsP1–nsP4), which form the replicase complex, as well as two promoters that regulate replication and translation processes. The objective of this study was to construct a plasmid vector, pVR100₋eGFP, carrying the non‑structural protein nsP1–nsP4 sequences of Venezuelan equine encephalomyelitis virus (VEEV) and the enhanced green fluorescent protein (eGFP) gene, for subsequent use as a DNA template to produce srRNA via in vitro transcription. During the research, the design of an intermediate (pAL2-T₋eGFP) and a final (pVR100₋eGFP) plasmid vector containing the eGFP gene sequence was developed. Original primers for cloning were designed, the optimal annealing temperature was determined via gradient PCR, and the eGFP fragment was obtained using nested PCR. The intermediate construct pAL2-T₋eGFP was generated by TA cloning and introduced into prokaryotic Escherichia coli DH5α cells. Directional cloning of the eGFP sequence from the intermediate vector into the target pVR100 vector was performed using PacI and PflFI restriction sites. Clone selection was carried out by real‑time PCR with a fluorescent probe and eGFP‑specific primers; the presence of the target gene in the obtained plasmid DNAs was confirmed by restriction analysis using PflFI, PacI and XbaI, as well as by 6 Sanger sequencing. The obtained results can be applied in the development of srRNA‑based therapeutic products.