Details

Важным прорывом в профилактике и терапии вирусных инфекций стало развитие мРНК–технологий и пептидных ингибиторов, направленных на подавление репликационного аппарата вируса гриппа А. В работе методами молекулярного клонирования и последующей in vitro транскрипцией (IVT) получены конструкции на основе вектора pIRESneo3, кодирующих зеленый флуоресцентный белок AcGFP, а также его слитые формы с пептидными последовательностями 6–14 и 6–25. В ходе выполнения данной работы выполнен дизайн трех оригинальных генетических конструкций: pIRESneo3-AcGFP, pIRESneo3-AcGFP-N3-6–14, pIRESneo3-AcGFP-N3-6–25. Рекомбинантные пДНК получены в клетках Escherichia coli штамма DH5α, наличие вставок подтверждено ПЦР с колоний и рестрикционным анализом. Препараты мРНК синтезированы методом IVT с концентрациями: мРНК-AcGFP - 26 мкг, мРНК-AcGFP-6-14 - 27 мкг, мРНК-AcGFP-6–25 - 32 мкг. Для количественной детекции разработаны оригинальные праймеры и TaqMan-зонды, оптимизированы условия ПЦР-РВ. Эффективность амплификации для всех конструкций составила 100%, подтверждая пригодность разработанных систем для количественной оценки целевых транскриптов.

A significant breakthrough in the prevention and therapy of viral infections has been the development of mRNA technologies and peptide inhibitors aimed at suppressing the replication machinery of the influenza A virus. In this work, using molecular cloning methods and subsequent in vitro transcription (IVT), constructs based on the pIRESneo3 vector encoding the green fluorescent protein AcGFP, as well as its fusion forms with peptide sequences 6–14 and 6–25, were obtained. This work involved the design of three original genetic constructs, namely pIRESneo3-AcGFP, pIRESneo3-AcGFP-N3-6-14, and pIRESneo3-AcGFP-N3-6-25. Recombinant plasmid DNAs were obtained in Escherichia coli DH5α cells; the presence of the target inserts was confirmed by colony PCR and restriction analysis. mRNA preparations were synthesized by IVT with the following concentrations: mRNA-AcGFP – 26 µg, mRNA-AcGFP-6-14 – 27 µg, and mRNA-AcGFP-6–25 – 32 µg. For quantitative detection, original primers and TaqMan probes were developed, and real-time PCR conditions were optimized. The amplification efficiency for all constructs was 100%, confirming the suitability of the developed systems for the quantitative assessment of target transcripts.