Details

Данная работа посвящена синтезу кольцевой молекулы РНК in vitro. Был выполнен дизайн генетической конструкции pGGA-cRNA-eGFP, которая использовалась в качестве матрицы для in vitro транскрипции. Каждый функциональный элемент pGGA-cRNA-eGFP, а именно: интроны тимидилатсинтазы бактериофага T4 для циркуляризации, 5`- и 3`- нетраслируемые области гена α2-гемоглобина человека, внутренний сайт посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита и ген зелёного флуоресцентного белка, был получен как отдельные конструкции на основе плазмидного вектора pAL2-T. Сборка pGGA-cRNA-eGFP осуществлялась методом Golden Gate. Синтетическая кольцевая РНК была получена методом перемешанных интронов-экзонов после in vitro транскрипции и очищена с использованием РНКазы R. Осуществлялась трансфекция клеток BHK-21 и Α549 синтетической кольцевой РНК. Была показана возможность экспрессии гена репортерного белка методом кэп-независимой трансляции с использованием IRES-элемента кольцевой молекулы РНК.

The given work is devoted to circular RNA synthesis in vitro. The design of pGGA-cRNA-eGFP genetic construct was conducted, pGGA-cRNA-eGFP was used as a template for in vitro transcription. Each functional element of pGGA- cRNA-eGFP (introns of T4 thydymilate synthase for circularization, 5`- and 3`- untranslated regions of human hemoglobin α2-subunit, encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site, enchanced green fluorescent protein gene) was obtained as separate genetic constructs. The assembly of the pGGA-cRNA was conducted via Golden Gate method. Synthetic circular RNA was generated via permuted intron- exon method after in vitro transcription and purified with RNase R. BHK-21 and A549 eukaryotic cell lines were used for transfection. The possibility of GFP expression with cap-independed translation method using IRES-element of circular RNA has been shown.