Details

Целью данной работы является разработка и получение рекомбинантных белков на основе ротавирусных белков VP6, VP7 и флагеллина сальмонеллы, как потенциальных компонентов рекомбинантной вакцины для профилактики ротавируса человека типа А. Ротавирусная инфекция остаётся ведущей причиной тяжёлого гастроэнтерита у детей до 5 лет, особенно в странах с низким уровнем дохода. Существующие живые оральные вакцины обладают сниженной эффективностью в регионах с высокой заболеваемостью ротавирусным гастроэнтеритом, а этиотропная терапия отсутствует. В связи с этим актуальной проблемой является разработка новых вариантов вакцин. В результате данной работы in silico был показан высокий потенциал белков FliB-VP6 и FliB-VP7 для активации перекрестного иммунитета и индукции выработки антител IgG и IgA, поэтому генетические конструкции, кодирующие данные белки были получены in vitro. Далее с полученных плазмид индуцировали экспрессию целевых белков. Хотя текущие результаты в значительной степени основаны на прогнозах in silico, вакцина имеет потенциал для активизации иммунной системы. Однако для подтверждения этих результатов необходимы обширные эксперименты в мокрой лаборатории с использованием животных моделей и последующие клинические испытания.

The aim of this work is to develop and produce a recombinant protein based on rotavirus proteins VP6, VP7 and Salmonella flagellin for a future vaccine against human rotavirus type A. Rotavirus infection remains the leading cause of severe gastroenteritis in children under 5 years of age, particularly in low-income countries. Existing live oral vaccines have reduced efficacy in regions with a high incidence of rotavirus gastroenteritis, and there is no causal treatment. Therefore, the development of new vaccine options is a pressing issue. This in silico study demonstrated the high potential of the FliB-VP6 and FliB-VP7 proteins to activate cross-immunity and induce IgG and IgA antibody production. Therefore, genetic constructs encoding these proteins were generated in vitro. The resulting plasmids were then used to induce expression of the target proteins. Although the current results are largely based on in silico predictions, the vaccine has the potential to activate the immune system. However, extensive wet lab experiments using animal models and subsequent clinical trials are needed to confirm these results.

• СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
• 1.1. Человеческий ротавирус, его строение и симптоматика
• 1.2. Классификация ротавирусов
• 1.3. Профилактика ротавирусной инфекции
• 1.3.1. Рекомбинантные вакцины
• 1.3.2. Разработка вакцин in silico
• 1.4. Моделирование белков и предсказание их структуры
• ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
• 2.1. Материалы
• 2.1.1. Плазмидный вектор для вставки ротавирусных генов
• 2.1.2. Программное обеспечение
• 2.1.3. Подбор нуклеотидных последовательностей ротавирусных белков
• 2.1.4. Праймеры для клонирования VP6 и VP7
• 2.2. Методы
• 2.2.1. Подбор нуклеотидных последовательностей ротавирусных белков
• 2.2.2. ОТ-ПЦР
• 2.2.3. ДНК электрофорез в 1% агарозном геле
• 2.2.4. Выделение ПЦР фрагмента из 1% агарозного геля
• 2.2.5. Выделение плазмиды из ночной культуры
• 2.2.6. Рестрикция плазмидного вектора и ПЦР-фрагмента
• 2.2.7. Лигирование ПЦР фрагмента в вектор pQE-30-FliB
• 2.2.8. Приготовление компетентных клеток E. coli
• 2.2.9. Трансформация компетентных клеток
• 2.2.10. ПЦР с Фьюжн полимеразой
• 2.2.11. Нанопоровое секвенирование
• 2.2.12. Экспрессия рекомбинантных белков
• 2.2.13. Разрушение клеточного осадка и телец включения E. сoli
• 2.2.14. Хроматографическая очистка рекомбинантных белков
• 2.2.15. Обессоливание
• 2.2.16. Электрофоретическое разделение белков в SDS полиакриламидном геле
• 2.2.17. Окрашивание SDS полиакриломидного геля после электрофореза
• 2.2.18. Подготовка образцов к масс-спектрометрическому анализу
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ