Details

Данная работа направлена на разработку способа получения рекомбинантных ферментов UvsX и UvsY для дальнейшей постановки рекомбиназной полимеразной амплификации. В работе были решены следующие задачи: 1. Проанализирована научная литература на тему рекомбиназной полимеразной амплификации и ферментов UvsX и UvsY; 2. Сконструированы плазмидные векторы для экспрессии рекомбинантных ферментов UvsX и UvsY; 3. Трансформированы клетки E. coli плазмидными векторами, несущими ген UvsX и UvsY; 4. Оптимизированы условия экспрессии рекомбинантных ферментов; 5. Выделены и очищены рекомбинантные ферменты; 6. Оценена активность полученных ферментов; 7. Сформулированы выводы. Исследования были проведены на базе ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Министерства обороны Российской Федерации». Были использованы следующие методы: синтез целевого гена de novo, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, электрофорез ДНК, лигирование, трансформация, ПЦР, секвенирование по методу Сэнгера, культивирование биомассы с индуктором, электрофорез в ПААГ, металл-аффинная хроматография, центральный композиционный план, методы статистического анализа. В результате исследования разработан способ получения рекомбинантных ферментов UvsX и UvsY, включающий подбор оптимальных условий экспрессии (для UvsX: ИПТГ 0,64 мМ, 5,5 ч, 33 °C; для UvsY: ИПТГ 0,53 мМ, 5,5 ч, 26 °C), что позволило получить 14 мг UvsX и 19 мг UvsY с 1 л культуры. Нуклеазная активность рекомбинантных ферментов подтверждена в реакции РПА. При выполнении литературного обзора использовались базы данных: eLIBRARY.RU; Scopus; ЭБС «Консультант студента». Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием пакета программ: Microsoft Exсel; Image Lab 6.1 Software; Design-Expert 13.0.5.0.

The given work is devoted to developing a method for producing recombinant UvsX and UvsY enzymes for subsequent recombinase polymerase amplification. The following tasks were accomplished in this study: 1. The scientific literature on recombinase polymerase amplification and the UvsX and UvsY enzymes was analyzed; 2. Plasmid vectors for the expression of recombinant UvsX and UvsY enzymes were constructed; 3. Transformation of E. coli cells with plasmid vectors carrying the UvsX and UvsY genes was performed; 4. The expression conditions for the recombinant enzymes were optimized; 5. The recombinant enzymes were isolated and purified; 6. The activity of the obtained enzymes was assessed; 7. Conclusions were formulated. The presented research was conducted at the State Institute for Experimental Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation. The following methods were used in the work: de novo synthesis, restriction, DNA electrophoresis, ligation, transformation, PCR, Sanger sequencing, biomass cultivation with an inducer, protein electrophoresis in PAGE, metal-affinity chromatography, central composite design, statistical analysis methods. As a result of the study, a method for producing recombinant UvsX and UvsY enzymes was developed, including optimal conditions for expression in the BL21(DE3) (for UvsX: IPTG 0.64 mM, 5.5 h, 33 °C; for UvsY: IPTG 0.53 mM, 5.5 h, 26 °C), which enabled the production of 14 mg of UvsX and 19 mg of UvsY per 1 L of culture. The nuclease activity of the recombinant UvsX and UvsY enzymes was confirmed in the RPA reaction. The literature review was based on the following databases: eLIBRARY.RU; Scopus; "Students Consultant" EBS. Statistical processing of experimental data was performed using the following software packages: Microsoft Excel; Image Lab 6.1 Software; Design-Expert 13.0.5.0.

• ВВЕДЕНИЕ
• Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
• 1.1. Рекомбиназная полимеразная амплификация (РПА)
• 1.1.1. Определение метода РПА
• 1.1.2. Основные этапы РПА
• 1.1.3. Ключевые белки и ферменты, участвующие в РПА
• 1.2. Рекомбиназа UvsX
• 1.2.1. Структурные особенности рекомбиназы UvsX
• 1.2.2. Активные центры рекомбиназы UvsX
• 1.2.3. Функции рекомбиназы UvsX
• 1.2.4. Области применения рекомбиназы UvsX
• 1.3. Рекомбиназа UvsY
• 1.3.1. Структурные особенности рекомбиназы UvsY
• 1.3.2. Активные центры рекомбиназы UvsY
• 1.3.3. Функции рекомбиназы UvsY
• 1.2.4. Области применения рекомбиназы UvsY
• 1.4. Получение и очистка рекомбинантных ферментов UvsX и UvsY
• Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
• 2.1. Объект и предмет исследования
• 2.1.1. Объект исследования
• 2.1.2. Предмет исследования
• 2.2. Материалы, реактивы и оборудование
• 2.2.1. Оборудование
• 2.2.2. Реактивы
• 2.2.3. Наборы реагентов
• 2.3. Методы исследования
• 2.3.1. Синтез целевого гена de novo
• 2.3.2. Сборка и клонирование рекомбинантных плазмид
• 2.3.3. Скрининг трансформантов методом ПЦР
• 2.3.4. Секвенирование рекомбинантных конструкций
• 2.3.5. Оптимизация условий экспрессии генов
• 2.3.6. Выделение, очистка и оценка активности рекомбинантных ферментов
• 2.4. Блок-схема эксперимента
• Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
• 3.1. Синтез целевого гена de novo
• 3.2. Сборка и клонирование рекомбинантных плазмид
• 3.3. Скрининг трансформантов методом ПЦР
• 3.4. Секвенирование рекомбинантных конструкций
• 3.5. Оптимизация условий экспрессии генов
• 3.6. Выделение, очистка и оценка активности рекомбинантных ферментов
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• Список использованных источников
• ПРИЛОЖЕНИЕ А
• Хроматограмма гена UvsX
• ПРИЛОЖЕНИЕ Б.
• Хроматограмма гена UvsY