Details

Объектом исследования являются молекулярно-генетические маркеры опухолей слюнных желез; предметом – ПЦР/qPCR-тест-система для детекции участков генов PLAG1, HMGA2 и TP53 в ДНК слюны. Цель работы – разработка лабораторного прототипа тест-системы для выявления указанных мишеней методами ПЦР и ПЦР в реальном времени. В ходе работы проведён анализ литературы, выполнен дизайн внешних и внутренних праймеров с использованием NCBI Primer-BLAST и SnapGene, сопоставлены способы выделения ДНК из слюны, проведены ПЦР-амплификация, электрофорез в агарозном геле, выделение ампликонов, клонирование в pJET1.2/blunt, химическая трансформация E. coli, выделение рекомбинантных плазмид и проверка внутренних праймеров методом qPCR с анализом кривых амплификации, плавления и калибровочных зависимостей. Получены и проверены плазмидные положительные контроли pJET1.2-PLAG1, pJET1.2-HMGA2 и pJET1.2-TP53. Для PLAG1 и TP53 показана воспроизводимая амплификация и построение калибровочных кривых; для HMGA2 выявлена необходимость редизайна внутренних праймеров. Разработанная схема может использоваться как основа для дальнейшей валидации тест-системы на образцах слюны. При выполнении работы использовались PubMed, eLIBRARY.RU и NCBI, NCBI Primer-BLAST, SnapGene, CFX Manager, ImageJ, Visual Studio Code, Python 3.12 и Microsoft Office.

The topic of the graduate qualification work is "Development of a test system for the detection of salivary gland tumors". The object of the study is molecular genetic markers of salivary gland tumors; the subject is a PCR/qPCR-based test system for detecting regions of the PLAG1, HMGA2 and TP53 genes in saliva DNA. The aim was to develop a laboratory prototype of the test system using conventional PCR and real-time PCR. The study included literature analysis, design of outer and inner primers using NCBI Primer-BLAST and SnapGene, comparison of saliva DNA extraction methods, PCR amplification, agarose gel electrophoresis, gel extraction of amplicons, cloning into pJET1.2/blunt, chemical transformation of E. coli, isolation of recombinant plasmids and testing of inner primers by qPCR with analysis of amplification curves, melting curves and calibration plots. Recombinant positive controls pJET1.2-PLAG1, pJET1.2-HMGA2 и pJET1.2-TP53 were obtained and verified. Reproducible amplification and calibration curve construction were demonstrated for PLAG1 and TP53, whereas HMGA2 required redesign of the inner primers. The developed scheme can serve as a basis for further validation of the test system using saliva samples. The work used PubMed, eLIBRARY.RU and NCBI databases, as well as NCBI Primer-BLAST, SnapGene, CFX Manager, ImageJ, Visual Studio Code, Python 3.12 and Microsoft Office software.

• ВВЕДЕНИЕ
• 1.ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
  • 1.1. Опухоли слюнных желез как объект молекулярной диагностики
    • 1.1.1. Эпидемиология и клиническая значимость
    • 1.1.2. Современная классификация и морфологическое разнообразие
    • 1.1.3. Диагностические трудности и место молекулярных методов
  • 1.2. Молекулярные маркеры, релевантные для разработки тест-системы
    • 1.2.1. PLAG1: биологическая функция и диагностическая роль
    • 1.2.2. HMGA2: биологическая функция и диагностическая роль
    • 1.2.3. TP53: биологическая функция и диагностическая роль
    • 1.2.4. Сравнительный анализ PLAG1, HMGA2 и TP53 как основы панели
  • 1.3. Методические основы построения тест-системы
    • 1.3.1. Слюна как биоматериал для молекулярной диагностики
    • 1.3.2. Выделение ДНК из слюны и факторы, определяющие качество матрицы
    • 1.3.3. ПЦР и ПЦР в реальном времени как основа аналитического сигнала
    • 1.3.4. Электрофорез в геле и кривые плавления как контроль специфичности
    • 1.3.5. Клонирование в pJET1.2, плазмидные контроли и валидация внутренних праймеров
  • 1.4. Обобщение литературных данных
• 2.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ
  • 2.1. Общая схема исследования
  • 2.2. Биологические объекты исследования
  • 2.3. Дизайн внешних и внутренних праймеров
  • 2.4. Выделение ДНК из слюны
    • 2.4.1. Термический лизис
    • 2.4.2. CTAB-протокол
    • 2.4.3. Выделение ДНК с использованием набора «Лира+»
    • 2.4.4. Выделение ДНК с использованием набора «ДНК-ЭКСТРАН-1»
  • 2.5. ПЦР-амплификация целевых фрагментов внешними праймерами
  • 2.6. Электрофорез и выделение ампликонов из агарозного геля
  • 2.7. Клонирование фрагментов PLAG1, HMGA2 и TP53 в pJET1.2
  • 2.8. Химическая трансформация и отбор бактериальных клонов
  • 2.9. Выделение и проверка рекомбинантных плазмид
  • 2.10. Проверка внутренних праймеров
  • 2.11. ПЦР в реальном времени
  • 2.12. Построение кривых амплификации, плавления и калибровочных зависимостей
• 3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
  • 3.1. Результаты дизайна праймеров
  • 3.2. Сравнение методов выделения ДНК из слюны
  • 3.3. Получение фрагментов PLAG1, HMGA2 и TP53 внешними праймерами
  • 3.4. Очистка целевых ампликонов из агарозного геля
  • 3.5. Получение рекомбинантных плазмид pJET1.2
  • 3.6. Проверка плазмидных положительных контролей внутренними праймерами
  • 3.7. Секвенирование рекомбинантных плазмид pJET1.2-HMGA2
  • 3.8. Результаты qPCR: кривые амплификации и плавления
  • 3.9. Построение калибровочных кривых
  • 3.10. Проблемы и ограничения разработанной системы, включая HMGA2
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ