Details

Данная работа посвящена созданию средств генетической инженерии эукариот на основе нуклеаз PpCas9 из Pasteurella pneumotropica и DfCas9 из Defluviimonas sp.20V17. В ходе работы были созданы эукариотические векторы, несущие CRISPR-PpCas9 и CRISPR-DfCas9 системы, была осуществлена проверка нуклеазной активности изучаемых систем в клетках человека HEK293T. CRISPR-DfCas9 система не показала эффективного редактирования генома клеток, в то время как CRISPR-PpCas9 оказалась способна вносить двунитевые разрывы в ДНК клеток человека. Эффективность работы CRISPR-PpCas9 системы была повышена путем подбора оптимальной длины спейсерной части направляющих РНК. Для доставки CRISPR-PpCas9 в живые организмы в виде AAV мы смогли максимально уменьшить размер векторной конструкции, несущей систему, и упаковать ее в вирусные капсиды. Таким образом, в результате данной работы было создано новое средство генетической инженерии эукариот на основе нуклеазы PpCas9 из Pasteurella pneumotropica – малоразмерная система, направленно вносящая разрывы в геномную ДНК клеток человека.

This work is devoted to the development of genome editing tools based on the nucleases PpCas9 from Pasteurella pneumotropica and DfCas9 from Defluviimonas sp. 20V17. In the course of the work, eukaryotic vectors carrying CRISPR-PpCas9 and CRISPR-DfCas9 systems were created, and the nuclease activity of PpCas9 and DfCas9 was tested in HEK293T human cells. The CRISPR-DfCas9 system did not demonstrate genome modification, while CRISPR-PpCas9 was able to introduce double-strand breaks in the genomic DNA. To improve the efficiency of the CRISPR-PpCas9 system we selected the optimal length of the spacer segment of the guide RNAs. To deliver CRISPR-PpCas9 to living organisms in the AAV form, we minimized the size of the vector carrying the system and package it in viral capsids. As a result of this work, a new tool for eukaryotic genome editing was created. It is based on the CRISPR-PpCas9 system from Pasteurella pneumotropica – a small-sized system that directionally introduces breaks in the genomic DNA of human cells.